張 鳳 呂建建 劉 萍① 高保全 李 健 陳 萍

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

甲殼類幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase)屬于 18家族糖苷鍵水解酶多家族基因(Zhanget al,2014),幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域典型: 第 18家族幾丁質(zhì)酶催化結(jié)構(gòu)域、富含S/T的連接區(qū)和結(jié)合幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,其基本功能可以特異降解幾丁質(zhì)。甲殼動(dòng)物在蛻皮過(guò)程中必須通過(guò)Chitinase消化舊的幾丁質(zhì)外骨骼。因此,Chitinase是甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)不可或缺的酶。除此之外,Chitinase在甲殼動(dòng)物中還具有其它重要的生理功能,包括消化幾丁質(zhì)類食物以及參與免疫防御等(Arakaneet al,2010; Zhanget al,2014)。相比昆蟲(chóng)而言(Zhuet al,2008; Arakaneet al,2010; Zhanget al,2011),由于缺少基因組背景,甲殼類Chitinase研究開(kāi)展較晚,然而由于其重要性,近幾年已成研究熱點(diǎn)。目前在中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)、日本仿長(zhǎng)額蝦(Pandalopsis japonica)以及日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)中均已開(kāi)展Chitinase基因克隆、分類及功能研究。研究表明: 甲殼類幾丁質(zhì)酶基因至少分六類(陳少波等,2004),可能在甲殼類蛻皮及消化中發(fā)揮重要作用(Huanget al,2010; Proespraiwonget al,2010; Zhanget al,2010;Rochaet al,2012; Zhanget al,2014)。

通過(guò)篩選本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高通量轉(zhuǎn)錄組文庫(kù),發(fā)掘到一個(gè)三疣梭子蟹Chitinase基因,命名為PtCht。該基因在不同鹽度脅迫下三疣梭子蟹鰓組織中顯著差異表達(dá)(Lvet al,2013),且通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)其不屬于任何一個(gè)已知甲殼類Chitinase分類,反而與昆蟲(chóng)Chitinase基因聚為一類,暗示其可能為甲殼類中新的Chitinase成員。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中PtCht基因部分序列,通過(guò)RACE技術(shù)克隆該基因cDNA全長(zhǎng); 通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR研究該基因在三疣梭子蟹各組織中的表達(dá)分布以及在不同蛻皮時(shí)期中表達(dá)規(guī)律; 同時(shí)研究其在三疣梭子蟹低鹽脅迫進(jìn)程中鰓和肝胰腺組織中的表達(dá)變化。研究結(jié)果將豐富甲殼類Chitinase研究?jī)?nèi)容,為進(jìn)一步研究甲殼類Chitinase的功能提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖在昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司的健康三疣梭子蟹,體質(zhì)量(5.78±1.11)g。暫養(yǎng)于 20m3的蟹池中,每池 200 只,共6池,暫養(yǎng)3d。自然海水養(yǎng)殖(鹽度33),水溫控制在24—26°C左右,pH 8.7,保持供氧充足,每天更換1/3的水量,暫養(yǎng)期間每天18:00喂食藍(lán)蛤。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

Trizol試劑分別提取各組織的總RNA,用核酸定量?jī)x(Biodropsis,BO-1000)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA的質(zhì)量及完整性; 分別取相同量的第六對(duì)鰓和肝胰腺的總 RNA 混勻,進(jìn)行 3′和 5′RACE 的cDNA第一鏈的合成,具體方法參照 SMARTTMRACE Amplification Kit說(shuō)明書。

1.3 全長(zhǎng)cDNA的克隆及測(cè)序

根據(jù)從三疣梭子蟹 cDNA文庫(kù)中獲得的Chitinase的EST序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì) 3′RACE 和 5′RACE 特異性引物。3′和 5′末端擴(kuò)增使用 Advantage 2 PCR Kit進(jìn)行。用特異性引物Cht-F和通用引物UPM進(jìn)行3′末端擴(kuò)增,用特異性引物Cht-R和通用引物UPM進(jìn)行5′末端擴(kuò)增(表1),方法同段亞飛等(2013)。PCR 程序設(shè)為: 94°C 30 s,65°C 1 min,72°C 3 min,30 個(gè)循環(huán)。

1.4 序列分析

利用Vecror NTI 11.0軟件對(duì)測(cè)得的序列去除冗余序列并進(jìn)行序列拼接,開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)和氨基酸的翻譯用軟件DNAStar的EditSeq完成(徐文斐等,2014)。同源性比對(duì)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析、蛋白信號(hào)肽分析、PtCht與其它物種的Cht氨基酸序列多序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的具體方法見(jiàn)段亞飛等(2013)。

表1 三疣梭子蟹Chitinase克隆和mRNA相對(duì)表達(dá)分析所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used for PtCht cloning and relative mRNA expression analysis

1.5 蛻皮周期實(shí)驗(yàn)

將三疣梭子蟹放在20m3蟹池自然海水中暫養(yǎng)3d,分2個(gè)池子,每池150只,按照朱冬發(fā)(沈潔等,2011)的方法,用解剖剪剪下游泳足趾節(jié)末端置于干凈載玻片上,于Olympus CX21FS顯微鏡下觀察,分別挑出處于蛻皮間期、前期、后期的三疣梭子蟹各3只。分別取第1對(duì)鰓、第6對(duì)鰓、腸、胃、表皮、肌肉、肝胰腺、心臟、眼柄、血細(xì)胞,于液氮中凍存,用于RNA的提取。

1.6 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑取暫養(yǎng) 3d的三疣梭子蟹分為 2組,對(duì)照組(自然海水33)和低鹽組(鹽度11),每組設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行100只,于3m3蟹池中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。低鹽組鹽度配制方法為往自然海水中注入淡水,混勻,使其鹽度降至11,用YSI鹽度儀進(jìn)行鹽度校準(zhǔn),具體方法見(jiàn)隋延鳴等(2012)。各組分別于脅迫0、3、6、12、24、48和72h取鰓和肝胰腺,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取3只三疣梭子蟹,于液氮中凍存,用于后續(xù)試驗(yàn)RNA的提取。

1.7 PtCht基因mRNA Real-time PCR定量檢測(cè)

Trizol試劑分別提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組三疣梭子蟹所取組織的總RNA,使用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)已知的三疣梭子蟹管家基因 β-actin和拼接獲得的PtCht基因cDNA全長(zhǎng)序列,分別設(shè)計(jì)一對(duì)正反特異引物(β-actin-F和β-actin-R、QCht-F 和 QCht-R)(表 1-1),對(duì)不同時(shí)間中鹽度脅迫的三疣梭子蟹鰓和肝胰腺中PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上利用Real-time PCR方法對(duì)脅迫進(jìn)程中以及各個(gè)組織中PtCht基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。采用 2–ΔΔCt方法計(jì)算PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量,使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

利用 Trizol試劑提取獲得三疣梭子蟹所取各個(gè)組織的總 RNA,經(jīng)核酸定量?jī)x檢測(cè),其 OD260/OD280均在1.9—2.0之間,總RNA有較高的純度; 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,呈現(xiàn) 3條清晰的條帶,分別是28S RNA、18S RNA和5S rRNA,表明總RNA完整性較好,可用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PtCht基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

以三疣梭子蟹鰓、肝胰腺和肌肉組織的總 RNA混合物為模板,反轉(zhuǎn)錄得到 3′RACE 和 5′RACE 的cDNA第一鏈。以特異引物Cht-F和Cht-R分別與通用引物UPM配對(duì),進(jìn)行3′和5′RACE擴(kuò)增,分別獲得大小為857bp和630bp的cDNA片段。將兩片段與已知表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)拼接,得到三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶 Chitinase基因 cDNA全長(zhǎng)序列,命名為PtCht,GenBank登錄號(hào): KM100753。該基因cDNA序列全長(zhǎng)為3694bp,其中,開(kāi)放閱讀框(ORF)3039bp,5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)200bp,3′非編碼區(qū)(3′-UTR)455bp。3'端存在加尾信號(hào)AATTAAA和多聚腺苷酸Poly A尾(圖 1)。

2.3 PtCht基因序列分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

氨基酸序列分析可知,PtCht基因編碼一個(gè)由1012個(gè)氨基酸組成的的蛋白質(zhì),分子量為 113.4kDa,理論等電點(diǎn)為6.289。氨基酸組成分析表明,PtCht蛋白帶有負(fù)電的氨基酸殘基為127個(gè)(Asp和Glu),帶有正電的氨基酸殘基為116個(gè)(Arg和Lys),疏水性氨基酸殘基為316個(gè)(Ala,Ile,Leu,Phe,Trp和Val),極性氨基酸殘基為253個(gè)(Asn,Cys,Gln,Ser,Thr和Tyr),不穩(wěn)定系數(shù)為 36.25,親水性總平均數(shù)為–0.458,屬于穩(wěn)定蛋白。結(jié)構(gòu)域分析表明,其N端含有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽,InterProScan軟件分析表明,PtCht序列存在兩個(gè)幾丁質(zhì)酶第 18家族活性位點(diǎn)228FDGLDLDWE236,664FDGLDIDWE672。在 113—457氨基酸和549—894氨基酸處分別存在兩個(gè)幾丁質(zhì)酶第 18家族催化結(jié)構(gòu)域,在 946—1004氨基酸處存在含6-Cys的Type-2幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChtBD2)。

2.4 PtCht基因的同源性分析

BLAST同源性分析三疣梭子蟹PtCht的氨基酸序列,得知三疣梭子蟹PtCht基因與亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)Cht的同源性最高,為74%。與其它物種如翅膀帶黑白斑的果蠅(Drosophila grimshawi)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiastr.)、嗜鳳梨果蠅(Drosophila ananassae)、黑翅果蠅(Drosophila persimilis)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的同源性分別為67%、73%、72%、72%和72%。通過(guò)與亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)和家蠶(Bombyx mori)等動(dòng)物的 Cht氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),幾丁質(zhì)酶第 18家族的催化結(jié)構(gòu)域保守基序MotifⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和含6個(gè)Cys的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域ChtBD2在幾個(gè)物種中都存在(圖2)。

利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,第18家族Ⅲ型幾丁質(zhì)酶主要聚為兩大類群: 昆蟲(chóng)類和甲殼動(dòng)物,三疣梭子蟹(P. trituberculatus)與昆蟲(chóng)類黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiastr.)緊密聚為一支,之后的聚類順序依次為與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)等(圖 3)。

2.5 PtCht基因組織表達(dá)分析

2.5.1PtCht基因的組織表達(dá)分布 利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析了三疣梭子蟹PtCht基因在不同組織中的表達(dá)分布特征,結(jié)果表明,PtCht基因在第 1對(duì)鰓、第6對(duì)鰓、眼柄、肝胰腺、血細(xì)胞、心臟、肌肉、胃和腸中均有表達(dá)。在所有實(shí)驗(yàn)組織中,表達(dá)量最高的是表皮,依次是眼柄、胃、第6對(duì)鰓、第1對(duì)鰓、腸、肌肉、和心臟,而在肝胰腺和血細(xì)胞中的表達(dá)量非常低(圖4)。

2.5.2PtCht基因在不同蛻皮周期中的表達(dá)分析三疣梭子蟹不同蛻皮周期中PtCht基因在表皮和眼柄中的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。與間期相比,在表皮中,前期PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào),后期PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào); 與間期相比,在眼柄中,前期和后期PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量呈整體上調(diào)趨勢(shì)。

2.5.3PtCht基因在鹽度脅迫中的表達(dá)分析 三疣梭子蟹鹽度脅迫后PtCht基因在第六對(duì)鰓中的相對(duì)表達(dá)量如圖 6所示。與對(duì)照組相比,低鹽脅迫組中,PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量于低鹽脅迫 3h后出現(xiàn)顯著下調(diào),6h出現(xiàn)輕微的上調(diào)后,于12h達(dá)到最小值,相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.30倍(P＜0.05); 隨后,PtCht的相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始顯著上調(diào),于24h達(dá)到最大值,相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.27倍(P＜0.05),隨后相對(duì)表達(dá)量于48—72h再次出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象(圖6)。

圖1 三疣梭子蟹PtCht基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列和其推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PtCht gene起始密碼子(ATG)、加尾信號(hào)(AATTAAA)和終止密碼子(TGA)用細(xì)線方框標(biāo)出; 粗線方框內(nèi)為幾丁質(zhì)酶第18家族保守基序; 信號(hào)肽以細(xì)下劃線標(biāo)出; ChtBD2結(jié)構(gòu)域用粗下劃線標(biāo)出

圖3 三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶蛋白PtCht的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis on chitinase protein of P. trituberculatus三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶蛋白PtCht; 各物種幾丁質(zhì)酶蛋白Cht GenBank登錄號(hào): 日本沼蝦Cht1A (KF466274.1); 日本沼蝦Cht1B(KF466275.1); 日本沼蝦Cht1C (AHL24866.1); 日本沼蝦Cht3A (KF466276.1); 日本沼蝦Cht3B (KF466277.1); 日本沼蝦Cht3C(KF466278.1); 日本沼蝦Cht4 (KF466279.1); 中國(guó)對(duì)蝦Cht1 (ABB85237.1); 中國(guó)對(duì)蝦Cht3 (DQ000159.1); 斑節(jié)對(duì)蝦Cht1 (AAD40313.1);斑節(jié)對(duì)蝦Cht2 (ADG22164.1); 斑節(jié)對(duì)蝦Cht3 (ADG22163.1); 鋸緣青蟹Cht (ABY85409.1); 鋸緣青蟹Cht1 (ACG60512.1); 鋸緣青蟹Cht2 (ACZ53950.1); 日本蟳Cht (AFF59213.1); 日本囊對(duì)蝦Cht1 (BAA12287); 日本囊對(duì)蝦Cht2 (BAA14014); 日本囊對(duì)蝦Cht3(BAA22854); 凡納濱對(duì)蝦Cht1 (EU883591.1); 凡納濱對(duì)蝦Cht2 (EU861222.1); 凡納濱對(duì)蝦Cht3 (AAN74647.1); 凡納濱對(duì)蝦Cht4(FJ888480.1); 凡納濱對(duì)蝦Cht5 (FJ888481.1); 凡納濱對(duì)蝦Cht6 (GQ916594.1); 日本仿長(zhǎng)額蝦Cht (AFC60660.1); 日本仿長(zhǎng)額蝦Cht1(JF694836.1); 日本仿長(zhǎng)額蝦Cht2 (JN982965.1); 日本仿長(zhǎng)額蝦Cht3 (JF694838.1); 日本仿長(zhǎng)額蝦Cht4 (JF694837.1); 黑腹果蠅Cht5(NP_650314.1); 黑腹果蠅Cht7 (NP_647768.2); 黑腹果蠅Cht8 (NP_611542.1); 黑腹果蠅Cht10 (EAA46011.1); 赤擬谷盜 Cht5(NP_001034524.1); 赤擬谷盜Cht7 (NP_001036035.1); 赤擬谷盜Cht8 (NP_001036067.1); 赤擬谷盜Cht10 (NP_001038091.1); 岡比亞按蚊Cht5-1 (HQ456129); 岡比亞按蚊Cht7 (XP_308858.4); 岡比亞按蚊Cht8 (XP_316448.2); 岡比亞按蚊Cht10 (XP_317398.3); 麗蠅蛹集金小蜂Cht5(NP_001155084.1); 亞洲玉米螟Cht (AGX32025.1); 小菜蛾Cht (AFI55112.1); 甜菜夜蛾Cht7 (AFM38213.1)

Real-time PCR檢測(cè)了三疣梭子蟹鹽度脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)肝胰腺中PtCht基因的相對(duì)表達(dá)情況。與對(duì)照組相比,低鹽脅迫后,PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量于3 h出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象,并于 12 h達(dá)到最小值,差異顯著(P＜0.05); 隨后于12—48 h出現(xiàn)顯著上調(diào),并于48 h達(dá)到最大值,相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的4.63倍(P＜0.05),然后于48—72 h出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象(圖7)。

圖4 三疣梭子蟹PtCht基因在不同組織中的表達(dá)分布Fig.4 Distribution of PtCht gene expression in different tissues of P. trituberculatus不同組織表達(dá)量均以與血細(xì)胞相比較的倍數(shù)表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

圖5 不同蛻皮周期三疣梭子蟹表皮和眼柄中PtCht基因的表達(dá)情況Fig.5 Expression of PtCht gene in P. trituberculatus cuticle and eyestalk tissues during different molting cycle不同組織各蛻皮周期表達(dá)量均以與表皮前期相比較的倍數(shù)表示,同組織不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

3 討論

幾丁質(zhì)酶在甲殼動(dòng)物的蛻皮過(guò)程中起著重要的生理作用,消化舊的外骨骼,將其變成可溶性物質(zhì),部分被機(jī)體重吸收,合成新的外骨骼(Huanget al,2010)。本實(shí)驗(yàn)克隆出一個(gè)全長(zhǎng)為3694bp的幾丁質(zhì)酶基因PtCht。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PtCht存在典型的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu),表明其具有幾丁質(zhì)分解活性,確為第 18家族幾丁質(zhì)酶家族成員(陳少波等,2004)。進(jìn)化樹(shù)分析表明其于已知的任何一種甲殼類幾丁質(zhì)酶成員均聚不到一類,反而與昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶基因聚為一支,PtCht含有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域,昆蟲(chóng)Ⅲ型幾丁質(zhì)酶也有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(Zhuet al,2008),廣泛存在于昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物中的Ⅲ型幾丁質(zhì)酶都?xì)w于第18 家族(Bormannet al,1999),暗示PtCht可能與昆蟲(chóng)一些幾丁質(zhì)酶基因同源。

圖6 低鹽脅迫下三疣梭子蟹第六對(duì)鰓中PtCht基因的表達(dá)情況Fig.6 Expression of PtCht gene in P. trituberculatus gill tissue under low salinity stress低鹽脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均以與各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照相比較的倍數(shù)表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

圖7 低鹽脅迫下PtCht基因在三疣梭子蟹肝胰腺中的表達(dá)變化Fig.7 Expression of PtCht in P. trituberculatus hepatopancreas tissue under low salinity stress低鹽脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均以與各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照相比較的倍數(shù)表示,不同英文字母表示差異顯著(P＜0.05)

甲殼動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育伴隨有周期性的蛻皮過(guò)程。眼柄-竇腺?gòu)?fù)合體為甲殼類重要的神經(jīng)內(nèi)分泌器官,是甲殼類蛻皮調(diào)控的重要器官,而甲殼類蛻皮首先需要降解舊的幾丁質(zhì)表皮,之后合成新的幾丁質(zhì)表皮,顯而易見(jiàn),眼柄和表皮是調(diào)控甲殼類蛻皮的關(guān)鍵組織。研究發(fā)現(xiàn),甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)酶在甲殼動(dòng)物蛻皮周期中發(fā)揮作用,但基因不同,其在蛻皮過(guò)程中起的作用也可能不同(呂黎等,2011)。日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)PjCht2(Watanabeet al,1996;Watanabeet al,1997)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)PmCht1(Tanet al,2000)和PmCht2(Zou,2009)、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis) (Priyaet al,2009)FcCht1和FcCht3、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)(Zhanget al,2014)MnCht1A、MnCht1B和MnCht3B等幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)在甲殼動(dòng)物不同蛻皮階段中表現(xiàn)出一定的波動(dòng)變化,這種變化和血淋巴中的蛻皮激素含量存在相關(guān)性(呂黎等,2011)。

本實(shí)驗(yàn)組織表達(dá)分布結(jié)果表明,PtCht基因在所研究組織中均有表達(dá),在表皮和眼柄中表達(dá)量較高,說(shuō)明該基因的主要功能很可能與三疣梭子蟹蛻皮相關(guān)。與間期相比,在表皮中,前期PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào),后期PtCht基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào),表達(dá)量達(dá)到最大; 與間期相比,在眼柄中,發(fā)現(xiàn)PtCht在蛻皮前期表達(dá)上調(diào),到后期表達(dá)量達(dá)到最大,表明幾丁質(zhì)酶 mRNA的表達(dá)可能受到了蛻皮激素的調(diào)節(jié)而參與蛻皮過(guò)程。這與昆蟲(chóng)第十八家族幾丁質(zhì)酶 groupⅠ基因的時(shí)空表達(dá)特性基本一致,東亞飛蝗(Locusta migratoria)LmCht1也是在表皮中特異表達(dá),并在昆蟲(chóng)發(fā)育后期表達(dá)量越來(lái)越高; 東亞飛蝗LmCht6在表皮中表達(dá)量也較高,隨著昆蟲(chóng)發(fā)育表達(dá)量越來(lái)越高,到成蟲(chóng)階段,表達(dá)量降低; RNAi結(jié)果表明LmCht6在東亞飛蝗蛻皮過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用(李大琪等,2011)。作為昆蟲(chóng)Ⅲ型幾丁質(zhì)酶成員赤擬谷盜TcCht7和黑腹果蠅DmCht7可能在組織分化中起作用(Renet al,2005),純化的壁虱Ⅲ型幾丁質(zhì)酶存在于新舊表皮之間,在蛻皮生理中發(fā)揮著一定的作用(Youet al,2003)。

鹽度變化可以開(kāi)啟甲殼動(dòng)物個(gè)體本身的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制,在一定閾值內(nèi),鹽度的下降會(huì)導(dǎo)致甲殼動(dòng)物蛻皮發(fā)育周期的縮短、蛻皮率增高,從而促進(jìn)甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)(Brayet al,1994; Muet al,2005; 楊其彬等,2008; 王沖等,2010)。鰓又是三疣梭子蟹的重要器官,可以在水中進(jìn)行氣體交換,調(diào)節(jié)滲透壓和調(diào)節(jié)離子平衡(韓曉琳等,2014)。比較本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),該基因在不同鹽度脅迫下三疣梭子蟹鰓中表達(dá)具有顯著差異(Lvet al,2013),這些結(jié)果均暗示第六對(duì)鰓可能參與三疣梭子蟹滲透壓調(diào)節(jié)進(jìn)程。低鹽脅迫下PtCht基因的表達(dá)在第六對(duì)鰓中總體呈先下調(diào)后稍微回升再下調(diào)到最低,再回升最后又下調(diào)的表達(dá)規(guī)律,在肝胰腺中呈現(xiàn)先下調(diào)后回升再下調(diào)的表達(dá)規(guī)律。表明PtCht基因參與了三疣梭子蟹低鹽脅迫應(yīng)答,在其透壓調(diào)節(jié)進(jìn)程中起到了一定的作用,提高了三疣梭子蟹抵抗鹽度脅迫的能力,但是其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探索。

4 結(jié)論

首次克隆出了三疣梭子蟹PtCht基因cDNA序列全長(zhǎng),分析PtCht基因在三疣梭子蟹蛻皮周期和低鹽脅迫進(jìn)程中的表達(dá)規(guī)律,得知PtCht基因在三疣梭子蟹蛻皮發(fā)育和滲透壓調(diào)節(jié)中都發(fā)揮了一定的作用,可初步認(rèn)為PtCht參與了三疣梭子蟹的鹽度適應(yīng)性調(diào)節(jié)過(guò)程,進(jìn)一步推測(cè)PtCht可能是鹽度影響三疣梭子蟹蛻皮的重要調(diào)控因子之一,為深入研究幾丁質(zhì)酶在三疣梭子蟹和其它甲殼動(dòng)物蛻皮機(jī)制中的功能提供了重要信息。

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