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        上皮細胞轉分化與IgA腎病臨床病理的相關性分析

        2015-03-08 02:11:04袁發(fā)煥
        重慶醫(yī)學 2015年2期
        關鍵詞:組織化學腎小管腎臟

        張 均,袁發(fā)煥,甘 華△

        (1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科 400016;2.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院腎內科,重慶400037)

        腎病是一組具有相同腎小球免疫病理特征的臨床癥候群,即腎組織活檢腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主要特征,也是引起終末期腎病的常見原因?;颊哐獕骸l(fā)病時血肌酐水平和尿蛋白定量作為判斷IgA腎病預后的臨床指標已得到公認[1]。近年隨著對上皮細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)研究的逐漸深入,其在IgA腎病的發(fā)展過程中的作用越來越受到關注。有研究指出血管生成是影響IgA腎病預后的獨立危險因素。本研究分析了168例IgA腎病患者腎組織轉錄因子(Snail)和平滑肌肌動蛋白-a(a-SMA)表達水平與常見臨床指標的相關性,以期為IgA腎病患者臨床病情進展尋找可靠的病理指標。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選擇2011年1月至2013年12月在新橋醫(yī)院腎內科經腎活檢診斷的原發(fā)性IgA腎病患者168例。其診斷標準依據1995年WHO制定的原發(fā)性腎小球疾病病理診斷分類標準,并排除過敏性紫癜、乙型肝炎病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝硬化、腫瘤等疾病引起的繼發(fā)性IgA腎??;急性腎小管間質病變、動脈病變及壞死病變。根據免疫組織化學染色分為Snail、a-SMA 高表達組(A 組,117例),Snail、a-SMA 低表達組(B組,51例),并對兩組患者年齡、性別、病程、體質量指數(BMI)、生化指標(肌酐、尿素氮、三酰甘油、24h尿蛋白定量、總膽固醇、血清清蛋白、血清總蛋白、血糖)及病理情況(Lee氏分級)進行統(tǒng)計學分析。

        1.2 方法

        1.2.1 病理組織取樣 采用Tru Cut活檢針在B超引導下經皮快速腎穿刺,每例標本在顯微鏡下隨機選擇10個高倍鏡視野,均行光鏡及免疫熒光檢查,病理科醫(yī)生專人負責閱片并遵循盲法。

        1.2.2 主要試劑 免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Snail兔抗人多克隆抗體(1∶200)及a-SMA兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)購自美國Abcam公司;羊抗兔IgG二抗(稀釋濃度1∶200)購自美國Rockland公司;

        1.2.3 組織病理分級 按照Lee氏分級標準分級。Ⅰ級:腎小管間質基本正常,腎小管表現為輕度變形擴張;Ⅱ級:腎小管萎縮程度、間質纖維化的范圍小于20%,可見散在炎性細胞的浸潤;Ⅲ級:腎小管萎縮程度、間質纖維化的范圍為30%~40%,散在和(或)彌漫性炎性細胞浸潤;Ⅳ級:腎小管萎縮程度、間質纖維化的范圍大于50%,散在和(或)彌漫炎性細胞浸潤[2]。

        1.2.4 免疫組織化學 采用二步法檢測腎臟組織Snail、a-SMA的表達,取腎臟組織石蠟切片進行梯度脫蠟水化后,抗原采用微波修復、山羊血清室溫封閉20min,依次加入兔抗Snail(1∶200),兔抗a-SMA多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜,次日加入相應二抗37℃孵育30min,用鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法37℃水浴箱孵育20min,隨后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色1~5min,經蘇木素復染胞核、乙醇梯度脫水、二甲苯透明,最后中性樹膠封片。同時以PBS代替一抗作為陰性對照。光學顯微鏡觀察、拍照計數,細胞胞質內呈棕褐色或棕黃色染色者為Snail、a-SMA陽性,不著色者為陰性。免疫組織化學染色結果判斷標準為,低表達:無著色或局灶節(jié)段弱陽性;高表達:局灶階段強陽性或彌漫性強陽性。

        1.3 統(tǒng)計學處理 所有數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,其中計量資料采用±s表示,兩組間比較采用t檢驗和方差分析,計數資料用百分數表示,采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 一般資料的比較 由表1可見,A組和B組在年齡和性別構成比方面差異無統(tǒng)計學意義。A組病程、BMI比例與B組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        表1 兩組IgA腎病患者一般資料的比較

        2.2 兩組間其他臨床指標的比較 A組肌酐、尿素氮、三酰甘油、24h尿蛋白定量與B組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而總膽固醇、血清清蛋白、血清總蛋白、血糖等指標與B組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

        表2 168例IgA腎病患者生化指標的比較(±s)

        表2 168例IgA腎病患者生化指標的比較(±s)

        a:P<0.05,與B組比較。

        項目 A組(n=117) B組(n=51)72.32±38.21尿素氮(mmol/L) 9.23±4.33a 4.52±2.21三酰甘油(mmol/L) 2.36±1.10a 1.22±0.92總膽固醇(mmol/L) 5.41±1.10 5.29±1.12血清總蛋白(g/L) 55.68±11.68 58.26±10.21血清清蛋白(g/L) 34.21±6.21 37.21±6.78血糖(mmol/L) 4.92±0.71 4.96±0.60 24h尿蛋白定量(mg/24h)3 207.56±607.32a肌酐(μmol/L) 162.78±120.23a 1 535.12±519.25

        2.3 Lee氏分級與Snail、a-SMA表達的關系 168例IgA腎病患者中Lee氏分級以Ⅲ級最多,占51.8%,其中A組Ⅲ級有59例(50.4%),B組Ⅲ級有28例(54.9%);B組病理分級多為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級,共有41例,其中Ⅰ+Ⅱ級占25.5%,Ⅳ+Ⅴ級占19.6%,而A組病理分級多在Ⅳ、Ⅴ級,共有47例,病理分級Ⅳ和Ⅴ級IgA腎病患者Snail、a-SMA高表達的比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ級(40.2%vs.9.4%),兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Lee氏分級及Snail、a-SMA免疫組織化學表達見圖1。

        圖1 兩組IgA腎病患者Lee氏分級及Snail、a-SMA免疫組織化學表達比較(×200)

        3 討 論

        IgA腎病是我國常見的原發(fā)性腎小球疾病之一,也是引起終末期腎病的主要原因之一,近些年發(fā)病率呈明顯上升趨勢[3]。EMT是指成熟的上皮細胞失去其上皮樣表型,并獲得未成熟的間充質表型的過程。發(fā)育生物學研究表明,哺乳動物的多種臟器在形成過程中都存在EMT的改變過程[4-5]。本研究發(fā)現,IgA腎病患者Snail、a-SMA的表達存在明顯異常,提示EMT與IgA腎病的病理類型密切相關。Strutz首先提出成年動物的腎小管上皮細胞能轉變成間充質樣的成纖維細胞,由此推測成年動物的腎臟也存在EMT的過程,之后也被稱為EMT[6]。EMT過程的本質上是細胞重塑的一種,EMT中細胞的標記蛋白、表型及功能上都將發(fā)生改變,例如喪失上皮細胞的表面標志、上皮鈣黏附素(E-caherin)、橋黏斑蛋白及β-鈣環(huán)黏素等;獲得間充質細胞標志:成纖維細胞特異性蛋白-1、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白等[6]。在腎臟,上皮系固有細胞包括腎小球臟層上皮細胞、腎小球壁層上皮細胞、腎小管上皮細胞。這3種上皮系細胞均可以發(fā)生EMT。隨著對腎小管上皮細胞在慢性腎臟疾病發(fā)生進展作用認識的不斷深入,目前已發(fā)現腎小管上皮細胞發(fā)生上皮細胞轉分化對腎臟纖維化至關重要。而腎小管上皮細胞發(fā)生EMT后可能存在如下結局:如果是短暫的損傷性刺激,細胞可恢復為正常腎小管上皮細胞;細胞增生并轉化為成纖維樣細胞;細胞發(fā)生凋亡;如果受到再生性信號刺激,細胞即可再分化為嶄新的上皮樣細胞[7]。研究表明,肌成纖維細胞是間充質的主要組成細胞之一,而a-SMA是肌成纖維細胞表型的標志蛋白[8]。慢性腎小球疾病的發(fā)展中,腎間質內表達a-SMA的肌成纖維細胞明顯增多,肌成纖維細胞是腎間質纖維化中細胞外基質的主要來源,因此其數量是判斷預后的重要指標。在對由單側輸尿管阻塞引起的阻塞性腎病時發(fā)現,在早期階段(1~3d),a-SMA表達呈升高趨勢,并且a-SMA陽性的細胞主要位于腎臟間質,同時發(fā)現,a-SMA的高表達并不同時伴隨有上皮細胞表型的轉化;在7d后,腎小管上皮細胞大量高表達a-SMA,并伴隨E-cadherin表達的減少。而在14d后,E-cadherin表達明顯降低,腎小管上皮細胞轉化為高表達a-SMA的成纖維樣細胞。Bai等[9]研究發(fā)現,在5/6腎切除大鼠,a-SMA陽性細胞數目與腎小管間質纖維化嚴重程度之間存在顯著正相關。研究表明,Snail作為一個重要的轉錄抑制子,其對EMT的調控作用已被證實,Snail被激活后轉移到細胞核,對許多靶基因起作用,其中最重要的是下調上皮細胞標記物E-cadherin[10]。Snail進入胞核后能與E-cadherin啟動子中特異性的DNA序列5′-CAC CTG-3′(又稱E-box元件)結合,抑制E-cadherin的轉錄,使其蛋白表達減少,上皮細胞間的黏附性喪失,從而觸發(fā)EMT[11]。本研究結果表明,Snail、a-SMA在IgA腎病患者腎組織中的高表達與腎臟病理Lee氏分級密切相關,提示EMT參與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展。有文獻表明,EMT的調節(jié)因素包括生長因子、細胞因子、激素及細胞外信號。其中最為熟知的當屬轉化生長因子-β1(TGF-β1),它在多種慢性腎臟疾病模型中的表達增強,而腎小管上皮細胞TGF-β1受體表達同時上調。除此之外還包括,表皮生長因子與成纖維生長因子-2能協(xié)同增強TGF-β1引起EMT的能力;基質金屬蛋白酶(MMP-2)也可通過激活TGF-β1而引起EMT[12]。因此,TGF-β1直接需與轉化生長因子-β受體 TGF-βRⅡ結合成復合物,發(fā)生二聚化,隨后便與轉化生長因子-β受體TGF-βRⅠ再形成四聚體,此時的構象發(fā)生了改變。在TGF-β1誘導上皮樣細胞發(fā)生EMT信號傳導主要是通過Smad分子依賴信號傳導途徑而起作用的。眾所周知,Smad蛋白是TGF-β1下游細胞內信號的重要轉導蛋白,也是TGF-β1超家族胞內信號通路中經典的信號分子。Smad受體是通過激活錨定蛋白調節(jié)Smad2和/或Smad3復合物形成;激活的Ⅰ型受體使Smad2和/或Smad3蛋白發(fā)生絲氨酸殘基磷酸化,隨后與Smad4蛋白結合后即可轉運到細胞核,在核內調控TGF-β1反應基因的轉錄。因此,TGF-β1引起的EMT主要是依賴Smad信號通路的。

        綜上所述,本課題選用公認和具有良好重復性的Lee氏分級作為評價標準,發(fā)現Snail、a-SMA在IgA腎病患者腎組織中的表達與腎臟病理lee氏分級密切相關,Snail、a-SMA高表達組患者中l(wèi)ee氏分級Ⅰ+Ⅱ級占9.4%、Ⅲ級占50.4%、Ⅳ+Ⅴ級占40.2%,而Snail、a-SMA低表達組患者中l(wèi)ee氏分級Ⅰ+Ⅱ級占25.5%、Ⅲ級占54.9%、Ⅳ+Ⅴ級占19.6%,提示Snail、a-SMA的高表達可作為IgA腎病預后不良的重要因素。但究竟是何種因素導致腎組織Snail、a-SMA的高表達,目前尚不清楚。在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中,Snail、a-SMA的表達次序及刺激因素,值得進一步深入探討。

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