肖著軍，蕭著玲，陳金敏，鄧飛鴻，許岸高

（1.惠州市中山大學惠亞醫(yī)院消化內科，廣東惠州516081；2.湖南省永州市藍山縣中心醫(yī)院消化科 425800；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科，廣州510515；4.廣東省惠州市醫(yī)學研究所 516003）

目前，全球大腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和病死率居第3位，而且有逐年上升的趨勢。在中國，隨著經(jīng)濟社會的快速發(fā)展，人們飲食結構發(fā)生較大變化，CRC發(fā)病率也逐年升高[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，診斷為CRC早期的患者中5年生存率可超過90%，而伴有淋巴結轉移的，5年生存率大約只有60%，如果出現(xiàn)有遠處轉移則5年生存率不到10%[2]。因此，CRC早期篩查是影響其預后的關鍵因素。而CRC篩查常用的糞便潛血（faecal occult blood testing，F(xiàn)OBT）、結腸鏡和CT結腸成像術等方法都難以完全達到安全簡便、接受性好和成本效益好等大規(guī)模篩查的要求，尋求更理想的篩查方法是當務之急。糞便DNA檢測作為一種非侵襲性、簡便并具有很高敏感性和特異性的方法深受人們的歡迎[3]。但是，目前糞便DNA檢測費用較高，還不能用于CRC的篩查[3-5]。自從2001年Worm等[6]首次運用高分辨率熔解曲線分析（high-resolution melting，HRM）檢測CpG島甲基化以來，先后有人用此技術檢測大腸腫瘤患者血液和組織中基因甲基化，其檢出率分別為48.0%[7]和33.3%～63.0%[8]，都取得了理想的結果。大量研究證實甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（methylation-sensitive high-resolution melting，MS-HRM）作為一種PCR后閉管操作技術，檢測基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等優(yōu)勢[9-10]。目前，國內外尚無評價 MS-HRM檢測患者糞便中基因甲基化篩查大腸腫瘤性能的研究報道。因此，本研究采用MS-HRM技術檢測CRC患者、進展期腺瘤（advanced adenomas，AA）患者和正常人糞便DNA中vimentin基因甲基化狀態(tài)來探討MS-HRM在CRC篩查中應用的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年9月至2013年1月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院內鏡中心行全結腸鏡檢查并經(jīng)病理證實的CRC患者27例（CRC組）、AA患者25例（AA組）和30例結腸鏡陰性對照者（對照組）的糞便樣本。CRC組和AA組納入標準：（1）年齡大于40歲、病理組織學檢查（均由兩位經(jīng)驗豐富的胃腸道病理學專家閱片判定）確診為結直腸AA（指直徑大于或等于1cm或組織學檢測為絨毛狀腺瘤或重度異型性增生的腺瘤）或CRC患者；（2）能收集合格糞便樣本的患者。CRC組和AA組排除標準：（1）家族性或遺傳性結直腸腺瘤或腫瘤；（2）伴有其他系統(tǒng)或器官腫瘤；（3）CRC或AA患者同時患有炎癥性腸?。唬?）術前有放療或化療史；（5）妊娠或有嚴重肝腎功能不全者；（6）非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況。對照組納入標準：（1）年齡、性別匹配；（2）腸鏡檢查陰性；（3）收集到合格糞便樣本。對照組排除標準：（1）各種原因而未行腸鏡檢查的；（2）收到的糞便樣本不合格。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準，患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 用商品化的糞便留樣瓶收集CRC患者、AA患者手術前和正常人新鮮糞便標本約3g，所有糞便標本收集后36h內保存于-80℃冰箱待測。

1.2.2 主要試劑和儀器 QIAamp DNA stool mini kit（50次）和EpiTect HRM PCR Kit（100次）購自德國Qiagen公司；CpGenome Universal Methylated DNA（10μg）和 CpGenome Universal Unmethylated DNA（10μg）購自美國 Millipore公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次）購自美國Zymoresearch公司；MS-HRM檢測采用全自動實時熒光定量PCR系統(tǒng)LightCycler480System（羅氏公司）；便隱血檢測試紙（膠體金人血紅蛋白單抗檢測法，萬華普曼生物工程有限公司）。

1.2.3 引物設計和合成 根據(jù)vimentin基因CpG島序列，由上海生工公司設計合成引物。vimentin基因的MS-HRM引物序列為，上游：5′-GCG ATG GTT TAG TTG TAA GTT GGT AGT-3′，下游：5′-CTA TCC CGC CGA TTA AAA ACT CCT A-3′，退火溫度為63℃，擴增片段長度為126bp。

1.2.4 糞便DNA的提取 按QIAamp DNA stool mini kit（Qiagen）說明書操作。稱取糞便約200mg于2mL EP管，加入1.6mL Buffer ASL渦旋混勻1min，使糞便溶解，13 000 r／min離心1min。吸取1.4mL上清液到新的2mL EP管，加入inhibitEX Tablet混勻1min，室溫靜置1min，吸收雜質，13 000r／min離心3min。吸25μL Proteinase K到新2mL EP管中，加入上清液600μL，Buffer AL 600μL，混勻，70℃溫浴10min。加600μL無水乙醇到裂解液，混勻。取吸附柱，加入上述裂解液，13 000r／min離心1min，棄廢液。加入500μL的AW1，13 000r／min離心1min，棄廢液。加入500μL的AW2，13 000r／min離心3min，棄廢液。最后回收DNA，溶于100μL Buffer AE，并保存在-20℃冰箱。DNA濃度和純度使用NanoDropND-1000UV Spectrophotometer分光光度計測定，DNA質量經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 亞硫酸氫鹽處理 取500ng DNA樣品，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次，zymoresearch）甲基化修飾試劑盒說明書進行甲基化修飾，修飾時間約為3.5h，修飾后的DNA在24h內進行PCR擴增。

1.2.6 MS-HRM 分 析 PCR 擴 增 和 HRM 在 LightCycler480System一個反應中完成，步驟按EpiTect HRM PCR Kit（100次，Qiagen）說明書進行，所有反應均可重復進行。25 μL反應體系包括：12.5μL 2xEpiTect HRM PCR Master Mix，上下游引物（10μmol／L）各1.9μL，0.2μL亞硫酸氫鹽修飾后DNA，8.5μL DEPC水；反應條件如下：95℃15min，然后95℃10s，55℃30s，72℃10s，共45個循環(huán)。擴增后HRM步驟，65℃1s，然后按0.02℃／s的速度從65℃升至95℃，每秒鐘收集25次熒光。最后40℃冷卻1s。使用Gene Scanning Software分析HRM的數(shù)據(jù)。

1.2.7 糞便潛血試驗 按照便隱血檢測試紙說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，基因頻率采用直接計數(shù)法，計數(shù)資料采用率表示，各組間比較采用χ2檢驗和Fisher′s精確概率法，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MS-HRM在3組糞便樣本中的陽性檢出率 糞便中vimentin基因甲基化陽性檢出率在CRC組、AA組和對照組中分別為81.5%（22／27），80.0%（20／25）和6.7%（2／30），病例組明顯高于對照組（χ2＝42.012，P＜0.05）。其中，CRC組和AA組均明顯高于對照組（χ2＝32.629，P＜0.05；χ2＝30.556，P＜0.05），而CRC組和 AA 組間差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.000，P＞0.05），見圖1。

圖1 vimentin基因的MS-HRM檢測結果。

2.2 FOBT在3組糞便樣本中的陽性檢出率 FOBT在CRC組、AA組和對照組中的陽性檢出率分別為37.0%（10／27）、12.0%（3／25）和3.3%（1／30），病例組明顯高于對照組（χ2＝6.308，P＜0.05）。其中，CRC 組明顯 高于對 照組（χ2＝10.365，P＜0.05），而 AA 組與對照組間無明顯差異（χ2＝0.506，P＞0.05）；CRC組的陽性檢出率明顯高于 AA組（χ2＝4.340，P＜0.05）。

2.3 MS-HRM和FOBT的診斷性能比較 在病例組中，MSHRM 和FOBT的診斷敏感性分別為80.8%（42／52）和25.0%（13／52），前者顯著高于后者（χ2＝32.454，P＜0.05）；在對照組中，兩者的診斷特異性分別為93.3%（28／30）和96.7%（29／30），兩者之間無明顯差異（χ2＝0.000，P＞0.05），見表1。

表1 3組中vimentin基因甲基化狀態(tài)[n（%）]

3 討 論

近年來我國CRC發(fā)病率呈升高趨勢，早期診斷是改善其預后的關鍵，篩查可以提高早期診斷率。與糞便潛血和腸鏡相比，糞便DNA檢測具有諸多優(yōu)勢，并被列入美國結直腸癌篩查指南的供選方法。除廉價外，糞便DNA檢測幾乎繼承了糞便潛血檢測所有優(yōu)點，而且具有更好的檢測性能，檢測CRC的敏感性達52%～91%，特異性達91%～97%[3]；更重要的是腺瘤檢出率更高，能有效地降低CRC的發(fā)病率。糞便DNA與糞便潛血單獨檢測AA的敏感性分別是18%和10%（P＜0.05），特異性相當，分別是94%和95%[3]。此外，糞便 DNA只需1次大便采樣[5，11-12]；它不受大腸腫瘤部位的影響[13]；DNA來源于大腸局部腫瘤本身，而且癌細胞的脫落量大，加上逃避了細胞凋亡，其DNA仍保持完整，這些都無形中提高了檢測的靈敏度[3，5，14]。

在CRC篩查的糞便DNA分子標記中，目前存在著一種以甲基化標記取代基因突變標記的趨勢[5]。Bosch等[5]總結近10年關于CRC糞便DNA標記物的研究發(fā)現(xiàn)，單個甲基化標記檢測能達到與一組基因突變標記相當?shù)男阅?。以基因突變作為糞便DNA篩查標記，其特異性和敏感性均不能滿足CRC篩查的要求，檢測CRC的敏感性為25%～73%，檢測大腸腺瘤的敏感性為15%～17%，特異性為94%～96%；而以單個基因甲基化為糞便DNA篩查標記，檢測CRC敏感性達38%～94%，檢測大腸腺瘤的敏感性為31%～70%，特異性為79%～100%[5]。因此，基因甲基化是篩查CRC較理想的生物標記。在眾多CRC早期篩查的糞便DNA甲基化標記中，vimentin是研究比較成熟并被充分證實具有很好檢測性能的基因[15]。有研究表明，vimentin基因在組織樣本中進行甲基化分析，檢測CRC和腺瘤的靈敏度分別是53%～83%和50%～84%[12，15]；通過糞便vimentin基因甲基化分析檢測 CRC 和AA的敏感性也分別達81%和83%，特異性為82%[16]。然而，目前常用基因甲基化檢測技術難以滿足便捷、經(jīng)濟、安全高效的大規(guī)模篩查要求，急需尋求更理想的檢測技術。

MS-HRM是表觀遺傳學中檢測CpG位點的最新技術。它主要是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量、堿基互補性差異和特定飽和染料可以插入DNA雙鏈中的特性，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，通過比較曲線的熔解溫度和峰形，在一系列的CpG位點中，檢測出單個甲基化的發(fā)生，也可以對平均甲基化水平進行分析，是一種PCR后閉管操作技術，無需序列特異性探針及PCR后繼分管處理，具有高通量、無污染、操作簡便快捷、靈敏度高、重復性好、成本低、不受檢測位點局限等優(yōu)勢[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，MS-HRM檢測CRC患者外周血中AKAP12基因啟動子甲基化的敏感性為48.0%，特異性為98.0%[7]；檢測CRC組織中 MGMT基因甲基化的敏感性為42.4%，特異性為91.0%[8]。這些研究都證實 MS-HRM檢測基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等優(yōu)勢。與血液、組織不同，糞便中人DNA含量極低，其平均濃度為100ng／g，大約只占總糞便DNA的0.01%，其他微生物和食物DNA卻占99.99%；而且糞便中的人DNA還包括來自正常大腸黏膜的DNA[17]。因此，從糞便中檢測人基因甲基化對檢測技術要求更高。

本研究應用MS-HRM技術檢測糞便中vimentin基因的甲基化狀態(tài)來篩查大腸腫瘤，在CRC和AA組中的診斷敏感性分別為81.5%和80.0%，在對照組中的診斷特異性為93.3%，診斷敏感性和特異性都在目前國外研究報道的范圍內（CRC和AA診斷敏感性分別為38.0%～86.0%和15.0%～83.0%，診斷特異性為73.0%～100.0%）[5，12，16]，且比較理想。FOBT具有操作簡便、價格低廉、非侵入性等優(yōu)點，是目前篩查CRC最常用的方法，但它敏感性和特異性欠佳。本研究中FOBT對CRC和AA的診斷敏感性分別為37.5%和12.0%，這與國外相關研究報道相近[3]，卻明顯低于筆者用 MS-HRM檢測基因甲基化對CRC和AA的診斷敏感性。兩種方法的特異性無明顯差異。研究已經(jīng)證實，絕大多數(shù)CRC是從癌前病變演變而來，遵循“早期腺瘤-進展期腺瘤-癌”的癌變模式[18]。對腺瘤尤其是AA進行檢測并及時處理，不僅可以降低CRC的病死率，還可以降低其發(fā)病率，因此，腺瘤才是預防篩查的真正目標。但是目前最常用的CRC篩查方法FOBT對腺瘤的檢出率太低[3，13]，對CRC的發(fā)病率影響較小。本試驗FOBT在AA組中的陽性率也只有12.0%，與對照組無明顯差異。而MS-HRM技術對AA的檢出率卻能達到80.0%，與CRC的檢出率相近。此外，F(xiàn)OBT還易受飲食及痔瘡、炎癥性腸病等其他疾病的影響，而MS-HRM方法不受飲食影響。顯然，應用MS-HRM檢測糞便中基因甲基化有望取代FOBT而作為CRC篩查的手段。

然而，研究發(fā)現(xiàn)vimentin基因并不只是在大腸腫瘤中發(fā)生甲基化，它還與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后相關，比如乳腺癌等[19]。更重要的是它在上消化道腫瘤中也有很高的檢出率，甚至可以作為篩查上消化道腫瘤的生物標記[20]。因此還需要對通過vimentin基因甲基化檢測篩查出來的CRC患者進行腸鏡等其他檢查方法以進一步確診。和FOBT結果受其他疾病影響一樣，這并不影響對應用MS-HRM技術來篩查CRC的性能評估。

[1] Wan DS.Epidemiologic trend of and strategies for colorectal cancer[J].Ai Zheng，2009，28（9）：897-902.

[2] Ries L，Melbert D，Krapcho M，et al.SEER cancer statistics review，1975-2005[Z].Bethesda：U.S.Natl Cancer，2008.

[3] Miller S，Steele S.Novel molecular screening approaches in colorectal cancer[J].J Surg Oncol，2012，105（5）：459-467.

[4] Lansdorp-Vogelaar I，Knudsen AB，Brenner H.Cost-effectiveness of colorectal cancer screening-an overview[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2010，24（4）：439-449.

[5] Bosch LJ，Carvalho B，F(xiàn)ijneman RJ，et al.Molecular tests for colorectal cancer screening[J].Clin Colorectal Cancer，2011，10（1）：8-23.

[6] Worm J，Aggerholm A，Guldberg P.In-tube DNA methylation profiling by fluorescence melting curve analysis[J].Clin Chem，2001，47（7）：1183-1189.

[7] Liu W，Guan M，Su B，et al.Rapid determination of AKAP12promoter methylation levels in peripheral blood using methylation-sensitive high resolution melting（MSHRM）analysis：application in colorectal cancer[J].Clin Chim Acta，2010，411（13／14）：940-946.

[8] Balic M，Pichler M，Strutz J，et al.High quality assessment of DNA methylation in archival tissues from colorectal cancer patients using quantitative high-resolution melting analysis[J].J Mol Diagn，2009，11（2）：102-108.

[9] Wittwer CT.High-resolution DNA melting analysis：advancements and limitations[J].Hum Mutat，2009，30（6）：857-859.

[10] Montgomery JL，Sanford LN，Wittwer CT.High-resolution DNA melting analysis in clinical research and diagnostics[J].Expert Rev Mol Diagn，2010，10（2）：219-240.

[11] van Dam L，Kuipers EJ，van Leerdam ME.Performance improvements of stool-based screening tests[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2010，24（4）：479-492.

[12] Ned RM，Melillo S，Marrone M.Fecal DNA testing for Colorectal Cancer Screening：the ColoSureTMtest[J].PLoS Curr，2011，3：RRN1220.

[13] Ahlquist DA，Sargent DJ，Loprinzi CL，et al.Stool DNA and occult blood testing for screen detection of colorectal neoplasia[J].Ann Intern Med，2008，149（7）：441-450，W81.

[14] Young GP，Bosch LJ.Fecal Tests：From Blood to Molecular Markers[J].Curr Colorectal Cancer Rep，2011，7（1）：62-70.

[15] Mikeska T，Bock C，Do H，et al.DNA methylation biomarkers in cancer：progress towards clinical implementation[J].Expert Rev Mol Diagn，2012，12（5）：473-487.

[16] Cummings LC，Cooper GS.Colorectal cancer screening：update for 2011[J].Semin Oncol，2011，38（4）：483-489.

[17] Osborn NK，Ahlquist DA.Stool screening for colorectal cancer：molecular approaches[J].Gastroenterology，2005，128（1）：192-206.

[18] Risio M.The natural history of colorectal adenomas and early cancer[J].Pathologe，2012，33Suppl 2：206-210.

[19] Ulirsch J，F(xiàn)an C，Knafl G，et al.Vimentin DNA methylation predicts survival in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2013，137（2）：383-396.

[20] Moinova H，Leidner RS，Ravi L，et al.Aberrant vimentin methylation is characteristic of upper gastrointestinal pathologies[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21（4）：594-600.