張啟芳，李曉燕，王媛媛，李西融，陳卓琳，鄭 奕，何思明，陳勇昌，姜海行△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西桂林541002；3.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院病理科，廣西桂林541002）

半乳糖凝集素3（Galectin-3，Gal-3）是一種生物體內(nèi)通過識(shí)別特異性半乳糖配基而發(fā)揮功能的糖蛋白，參與細(xì)胞黏附、增殖、分化、血管生成、凋亡等多種生物功能[1]。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B cell leukemia／lymphoma-2，Bcl-2）是細(xì)胞凋亡的抑制基因，它的激活和過度表達(dá)能抑制細(xì)胞的正常凋亡[2]。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是腸道慢性非特異性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡在UC組織損傷和免疫功能紊亂中起著重要的作用[3]。Gal-3與Bcl-2在結(jié)構(gòu)上相似，可能在細(xì)胞凋亡中存在共同的凋亡途徑。本文采用免疫組織化學(xué)SP法檢測UC患者大腸黏膜組織中Gal-3和Bcl-2的表達(dá)，探討兩者在UC發(fā)病中的作用及關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2013年6月在廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科住院或門診確診的UC患者60例（UC組）為研究對(duì)象，其中男39例，女21例，年齡17～77歲，平均（44.25±12.43）歲。健康體檢例行腸鏡檢查者20例（對(duì)照組）為對(duì)照，其中男10例，女10例，年齡20～66歲，平均（43.60±13.18）歲。全部病例均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組制定的《對(duì)我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見》[4]。病變按Riley等分級(jí)法，根據(jù)腸鏡下UC的表現(xiàn)，將病變程度分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)。Ⅰ級(jí)：黏膜充血，黏膜下血管網(wǎng)不清，有淤斑；Ⅱ級(jí)：黏膜明顯充血水腫，黏膜呈細(xì)顆粒狀、質(zhì)脆，有小潰瘍形成；Ⅲ級(jí)：黏膜粗糙呈顆粒狀，有自發(fā)性出血，淺小潰瘍?nèi)诤?，覆有少量的黏液膿血及血性滲出物[5]。病例分為3組：Ⅰ級(jí)組21例，Ⅱ級(jí)組20例，Ⅲ級(jí)組19例。研究方案經(jīng)廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得研究對(duì)象知情同意。所有標(biāo)本在患者行結(jié)腸鏡檢查時(shí)活檢留取，取乙狀結(jié)腸和（或）直腸黏膜組織，10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋保存。正常對(duì)照者在乙狀結(jié)腸和（或）直腸活檢。

1.2 方法

1.2.1 Gal-3與Bcl-2的檢測 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測Gal-3與Bcl-2在患者大腸黏膜組織中的表達(dá)。一抗為兔抗人Gal-3或Bcl-2多克隆抗體，購自ABGENT公司；二抗為辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG（H＋L），購自Jackson Immunoresearch公司。具體方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS沖洗，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗，加入一抗：兔抗人Gal-3抗體（1∶2 000）或Bcl-2抗體（1∶100），恒溫箱孵育2h，PBS沖洗，加入二抗、恒溫箱孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水，烤干封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

1.2.2 Gal-3與Bcl-2結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。光鏡下半定量結(jié)果判斷參照許良中等[6]的方法。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色3分，棕黃色2分，淡黃色1分，無著色0分。同樣物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)：一個(gè)視野內(nèi)著色細(xì)胞大于75%為4分；＞50%～75%為3分；＞10%～50%為2分；≤10%為1分；陰性為0分。兩項(xiàng)得分相乘：0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.2.3 研究指標(biāo) 觀察Gal-3和Bcl-2在UC和正常大腸黏膜組織的表達(dá)，并研究二者表達(dá)與UC不同腸鏡分級(jí)間及患者臨床特征的關(guān)系。討論UC大腸黏膜組織Gal-3和Bcl-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；采用Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)UC大腸組織中Gal-3和Bcl-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cal-3和Bcl-2在UC和正常大腸黏膜組織的表達(dá) Gal-3的表達(dá)位于大腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色顆粒。Gal-3在正常大腸組織切片中均有較強(qiáng)的表達(dá)，分布較均勻，但在UC大腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)則顯著降低，呈斑點(diǎn)狀、不均勻，見圖1、2。Gal-3在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞的陽性表達(dá)率為100%（20／20），在UC腸黏膜上皮細(xì)胞的陽性表達(dá)率則為38.33%（23／60），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

Bcl-2表達(dá)位于大腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色顆粒。Bcl-2在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞中呈弱表達(dá)，主要表達(dá)于結(jié)腸隱窩基底部，而在UC大腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要為固有層炎性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）的表達(dá)增強(qiáng)，見圖3、4。Bcl-2在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為20.00%（4／20），而 UC的陽性表達(dá)率為88.33%（53／60），UC大腸黏膜上皮的Bcl-2表達(dá)較正常大腸黏膜上皮明顯增強(qiáng)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 Gal-3在正常大腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）

圖2 Gal-3在UC大腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）

圖3 Bcl-2在正常大腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×400）

2.2 Gal-3和Bcl-2表達(dá)與UC不同腸鏡分級(jí)間及患者臨床特征的關(guān)系 Gal-3在UCⅠ級(jí)與Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Ⅱ級(jí)與Ⅲ級(jí)間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同腸鏡UC分級(jí)間Bcl-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。Gal-3和Bcl-2的表達(dá)與UC患者的年齡、性別、病程均無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

圖4 Bcl-2在UC大腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)（SP，×200）

表1 Gal-3和Bcl-2表達(dá)與UC不同內(nèi)鏡分級(jí)間的關(guān)系[n（%）]

表2 Gal-3和Bcl-2表達(dá)與UC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 UC大腸黏膜組織Gal-3和Bcl-2表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 UC組中，Gal-3與Bcl-2共同陽性表達(dá)的有22例，共同陽性表達(dá)率為36.67%，Pearson相關(guān)分析顯示兩者的陽性表達(dá)程度不具有關(guān)聯(lián)性（r＝0，P＞0.05）。

3 討 論

Gal-3是半乳糖凝集素的成員之一，是半乳凝集素家族中唯一的一個(gè)具有合型結(jié)構(gòu)并可抑制細(xì)胞凋亡的半乳凝集素蛋白[7]，屬于半乳糖凝集素蛋白家族，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。Bcl-2基因位于18號(hào)染色體長臂，屬于抑制凋亡基因家族中的一個(gè)重要成員，其主要通過抑制細(xì)胞凋亡來延長細(xì)胞存活時(shí)間，又被稱為“生存基因”。正常結(jié)腸上皮細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，主要發(fā)生在隱窩和絨毛頂部，意義在于調(diào)控進(jìn)入隱窩及絨毛軸的細(xì)胞數(shù)量，通過清除衰老細(xì)胞來保持腸上皮的完整性，是腸上皮細(xì)胞更新的生理過程。同時(shí)，活化的炎性細(xì)胞較靜息細(xì)胞更容易凋亡，正常情況下，因?yàn)槟c黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞處于高的激活狀態(tài)，使凋亡增加，從而維持腸黏膜微環(huán)境的免疫穩(wěn)定，在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Bcl-2基因家族起關(guān)鍵作用[8]。

Gal-3的表達(dá)部位在大腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，正常大腸黏膜上皮細(xì)胞呈強(qiáng)表達(dá)，而在UC大腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)則明顯減低，其表達(dá)陽性率與腸鏡下病變程度的比較顯示Gal-3的表達(dá)陽性率與UC腸鏡下病變程度有關(guān)，即炎癥輕的Ⅰ級(jí)組織表達(dá)高，炎癥重的Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)組織表達(dá)低，但是與患者的年齡、性別、病史長短無明顯相關(guān)性。Bcl-2的表達(dá)部位也在細(xì)胞質(zhì)，正常大腸上皮有弱表達(dá)，主要表達(dá)于結(jié)腸隱窩基底部，保證上皮細(xì)胞增生和更新，以維持結(jié)腸黏膜屏障的動(dòng)態(tài)平衡；UC患者大腸黏膜Bcl-2表達(dá)上調(diào)是對(duì)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的一種反應(yīng)性增生，可能與隱窩上皮細(xì)胞再生修復(fù)有關(guān)。本研究中，UC患者Bcl-2表達(dá)明顯增多，與正常對(duì)照比較差異明顯，主要表現(xiàn)為固有層炎性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示炎性細(xì)胞凋亡明顯減慢，導(dǎo)致UC大腸黏膜炎癥的持續(xù)存在?？梢姡竽c黏膜活檢組織中凋亡調(diào)控蛋白Gal-3和Bcl-2的異常表達(dá)在UC的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

Gal-3與Bcl-2的序列相似，Gal-3含有4個(gè)與Bcl-2基因一樣的氨基酸組合，而這些組合正是Bcl-2抗細(xì)胞凋亡作用的關(guān)鍵部位，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮Y(jié)構(gòu)上的相似，可能在細(xì)胞凋亡中存在共同的凋亡途徑[9]。國內(nèi)學(xué)者龐霞等[10]研究表明在食管鱗癌組織中Gal-3與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在食管癌的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用。但是本組資料通過關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析未能證實(shí)Gal-3與Bcl-2在UC大腸組織中的陽性表達(dá)程度具有關(guān)聯(lián)性，提示兩者在UC的發(fā)病中可能獨(dú)立起作用，但尚需要大樣本量病例進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，Gal-3和Bcl-2蛋白在UC的發(fā)病中可能獨(dú)立起作用，并在發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，可望成為UC早期診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)。

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