呂一冬，劉秀珍，王宏月，魏昌偉，王卓強(qiáng)，陳 劍

（1.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221004；2.解放軍第309醫(yī)院麻醉科，北京100091）

Morris水迷宮為實(shí)驗(yàn)動物對空間學(xué)習(xí)和記憶的過程提供了客觀準(zhǔn)確的評價(jià)指標(biāo)，全面記錄實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶過程，客觀地反映其認(rèn)知水平[1]。本實(shí)驗(yàn)參照 Melgar等[2]的模型，實(shí)驗(yàn)動物以股動脈穿刺大量放血模擬外科手術(shù)中的大量失血，探討老年大鼠大量失血后空間學(xué)習(xí)記憶能力是否受到影響，并通過Morris水迷宮對老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD老年大鼠56只（18月齡，雄性）來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，分為空白組（B組，n＝8）、對照組（C組，n＝24）、大量失血組（H組，n＝24）。其中C組、H組再分別分為術(shù)后1d組（C1組，n＝8；H1組，n＝8），術(shù)后3d組（C3組，n＝8；H3組，n＝8），術(shù)后7d組（C7組，n＝8；H7組，n＝8）。

1.2 方法

1.2.1 動物處理 所有實(shí)驗(yàn)動物放入獨(dú)立通氣籠內(nèi)飼養(yǎng)，在濕度55%～58%，溫度20～25℃的環(huán)境中給予充足的食物和水，適應(yīng)1周。B組不做任何處理。C組和H組用2%的戊巴比妥鈉（50mg／kg，腹腔注射）麻醉后，C組先分離股動脈，然后進(jìn)行結(jié)扎縫合，H組先行股動脈穿刺，然后行股動脈放血，最后結(jié)扎縫合（具體操作：老年大鼠麻醉后備皮消毒，于右側(cè)腹股溝股動脈搏動最明顯處剪開皮膚，股動脈位置較深，充分暴露后分離股動脈并在近、遠(yuǎn)側(cè)端穿線備用。用4.5號頭皮針連接肝素化的注射器穿刺放血）。參照Peng等[3]對老年大鼠失血性休克生理變化的研究，綜合考慮失血后老年大鼠的生存率，確定放血量為老年大鼠總血容量（按65mL／kg計(jì)算）的25%，放血時(shí)間維持5min以上。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮為直徑1.6m的圓形水槽（水溫24～25℃），分為4個(gè)象限，四周環(huán)境各不相同。其中1個(gè)象限在水下0.5cm處放置一個(gè)圓形平臺。老年大鼠在術(shù)前進(jìn)行連續(xù)5d的訓(xùn)練，每天3次。每次訓(xùn)練前讓其在平臺上適應(yīng)30s，熟悉、記憶周圍環(huán)境，然后在對側(cè)象限將其背對水槽壁放入自由游泳60s，找到平臺后在平臺上停留30 s，若在60s內(nèi)未能到達(dá)平臺則引導(dǎo)老年大鼠找到平臺停留30 s。老年大鼠全部訓(xùn)練1次結(jié)束后重復(fù)第2、3次訓(xùn)練，不同的是分別從平臺相鄰的2個(gè)象限放入。C組，H組分別在術(shù)后1、3、7d應(yīng)用Morris水迷宮檢測老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。不同的是將平臺放至對側(cè)象限，觀察其是否能通過學(xué)習(xí)和記憶迅速找到平臺位置[4]。記錄老年大鼠游行過程中的游行距離、時(shí)間（逃避潛伏期）和速度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，術(shù)前數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，術(shù)后所得數(shù)據(jù)總體比較用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 老年大鼠不同時(shí)段Morris水迷宮軌跡圖 平臺放于第3象限，老年大鼠入水點(diǎn)為第1象限。

2.1.1 術(shù)前老年大鼠Morris水迷宮訓(xùn)練圖 見圖1。

2.1.2 術(shù)后1d老年大鼠Morris水迷宮軌跡圖 見圖2。

2.1.3 術(shù)后3d老年大鼠Morris水迷宮軌跡圖 見圖3。

2.1.4 術(shù)后7d老年大鼠Morris水迷宮軌跡圖 見圖4。

圖1 術(shù)前老年大鼠游行軌跡圖

圖2 術(shù)后1d3組老年大鼠游行軌跡圖

圖3 術(shù)后3d3組老年大鼠游行軌跡圖

2.2 老年大鼠不同時(shí)段游行過程中的逃避潛伏期和游行速度

2.2.1 術(shù)前訓(xùn)練結(jié)果 經(jīng)重復(fù)測量方差分析計(jì)算時(shí)間因素效應(yīng)：F＝233.194，P＝0.000，分組因素效應(yīng)：F＝0.453，P＝0.838。結(jié)果表明：隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，老年大鼠能通過對空間記憶的學(xué)習(xí)迅速找到平臺。分組效應(yīng)的結(jié)果提示術(shù)前各組之間老年大鼠的空間記憶學(xué)習(xí)能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

圖4 術(shù)后7d3組老年大鼠游行軌跡圖

表1 術(shù)前訓(xùn)練各組的平均逃避潛伏期（±s，s）

表1 術(shù)前訓(xùn)練各組的平均逃避潛伏期（±s，s）

1d 2d 3d 4d 5d B組 8 59.7±0.06 44.44±16.62 20.99±9.70 13.93±6.組別n 03 10.17±3.60 C1組 8 59.77±0.25 35.05±11.01 20.95±13.34 16.02±6.84 10.93±3.96 H1組 8 59.67±0.06 41.16±12.34 20.11±10.13 17.01±9.32 11.41±3.71 C3組 8 59.67±0.07 40.12±9.46 23.18±12.57 15.39±7.68 9.83±3.01 H3組 8 59.69±0.07 42.92±8.49 25.89±9.66 18.09±11.96 11.30±4.16 C7組 8 59.69±0.06 37.43±14.49 30.48±8.02 19.61±10.09 9.86±3.55 H7組 8 59.72±0.07 41.44±13.07 25.37±11.58 12.91±6.36 13.86±7.45

2.2.2 術(shù)后不同時(shí)段各組間逃避潛伏期和游行速度 與B組比較，C組和H組術(shù)后1、3d的游行速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與B組比較，C組術(shù)后1、3d的逃避潛伏期無明顯變化，而H組術(shù)后1、3d的逃避潛伏期明顯增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而B組分別與術(shù)后7dC組和H組比較逃避潛伏期和游行速度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 術(shù)后1、3、7d各組間逃避潛伏期和游行速度（±s）

a：P＜0.05，與B組比較。

組別 n 逃避潛伏期（s） 游行速度（m／s）B組8 12.56±3.08 27.68±3.27 C1組 8 15.74±5.86 25.92±3.81 H1組 8 29.93±7.93a 26.33±3.88 C3組 8 15.61±2.56 25.76±3.20 H3組 8 34.56±6.74a 28.98±5.11 C7組 8 13.56±4.61 27.23±5.05 H7組8 15.47±6.42 26.01±4.96

3 討 論

Morris水迷宮是評估空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種常用實(shí)驗(yàn)方法，其原理是經(jīng)過反復(fù)多次訓(xùn)練使實(shí)驗(yàn)動物學(xué)會尋找隱蔽的平臺，通過學(xué)習(xí)和記憶形成穩(wěn)定的空間認(rèn)知能力[5]。通過Morris水迷宮術(shù)前5d的訓(xùn)練證明，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增多，老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力得到了提高。

本研究主要從記憶力方面對老年大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行研究，即通過老年大鼠對某種任務(wù)的學(xué)習(xí)記憶、鞏固和再現(xiàn)來評估其認(rèn)知功能。通過對術(shù)后老年大鼠逃避潛伏期及游行速度統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)C1、C3、C7組與B組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明手術(shù)創(chuàng)傷及股動脈結(jié)扎并未影響大鼠的運(yùn)動能力，也沒有對老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響。然而H1和H3組老年大鼠的逃避潛伏期與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力在大量失血后第1天遭到損害，并且第3天損害更為嚴(yán)重，在第7天時(shí)恢復(fù)。結(jié)果提示老年大鼠急性大量失血后在未能及時(shí)補(bǔ)充血容量的情況下，可以導(dǎo)致其發(fā)生以空間學(xué)習(xí)記憶能力受損為主要表現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙，與曹學(xué)照等[4]的研究結(jié)果相一致。

Cao等[6]對老年大鼠行肝部分切除術(shù)并在術(shù)后應(yīng)用Morris水迷宮評估其空間學(xué)習(xí)記憶能力，證實(shí)了中等大小手術(shù)創(chuàng)傷可影響實(shí)驗(yàn)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。劉漢興等[7]對大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致大鼠慢性腦缺血來研究，證實(shí)慢性腦缺血造成了大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

目前大量失血導(dǎo)致老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損害的機(jī)制是否與手術(shù)創(chuàng)傷或者慢性腦缺血引起其損害的機(jī)制相同尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道急性大量失血后體循環(huán)血容量減少、全腦血流量減少、腦灌注壓下降，同時(shí)急性貧血導(dǎo)致血液系統(tǒng)攜氧能力降低，可使局部組織缺氧[8-9]。還可能直接影響中樞神經(jīng)細(xì)胞功能，導(dǎo)致海馬、前腦室白質(zhì)及基底神經(jīng)節(jié)等敏感性區(qū)域發(fā)生缺血缺氧性損害，進(jìn)而失血后認(rèn)知功能、記憶能力受到影響[10-11]。

Paul等[12]研究發(fā)現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力依賴于完整的海馬結(jié)構(gòu)，但是也有研究發(fā)現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能的障礙也可發(fā)生在無海馬結(jié)構(gòu)破壞但是有慢性腦血流低灌注導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷的大鼠[13]。尚游等[14]通過對兔失血性休克的研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克發(fā)生時(shí)實(shí)驗(yàn)兔血漿中的腎上腺素等激素水平明顯升高，證實(shí)失血性休克引發(fā)了嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，腎上腺皮質(zhì)激素受體存在于與認(rèn)知功能密切相關(guān)的海馬區(qū)，應(yīng)激時(shí)糖皮質(zhì)激素分泌增加，長時(shí)間高水平的糖皮質(zhì)激素可造成海馬神經(jīng)元的損害，這種損害長期存在導(dǎo)致海馬區(qū)糖皮質(zhì)激素受體減少，減弱了對腎上腺皮質(zhì)的反饋抑制作用，進(jìn)而使糖皮質(zhì)激素處于高分泌狀態(tài)，最終使海馬神經(jīng)元發(fā)生永久性損害，造成其學(xué)習(xí)與記憶能力受損[15]。因此老年大鼠急性大量失血后認(rèn)知功能障礙發(fā)生可能與應(yīng)激及腦組織缺血缺氧有關(guān)，其發(fā)生機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1] Brandeis R，Brandys Y，Yehuda S.The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning[J].Int J Neurosci，1989，48（1／2）：29-69.

[2] Melgar MA，Park H，Rafols JA.A model of global forebrain ischemia／reperfusion in the awake rat[J].Neurol Res，2002，24（1）：97-106.

[3] Peng TC，Liao KW，Lai HL，et al.The physiological changes of cumulative hemorrhagic shock in conscious rats[J].J Biomed Sci，2006，13（3）：385-394.

[4] 曹學(xué)照，郭麗麗，馬虹，等.手術(shù)創(chuàng)傷對老年鼠和成年鼠術(shù)后空間學(xué)習(xí)憶能力的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41（9）：809-812.

[5] D′Hooge R，De Deyn PP.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory[J].Brain Res Rev，2001，36（1）：60-90.

[6] Cao XZ，Ma H，Wang JK，et al.Postoperative cognitive deficits and neuroinflammation in the hippocampus triggered by surgical trauma are exacerbated in aged rats[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2010，34（8）：1426-1432.

[7] 劉漢興，章建軍，張磊，等.Tempol對慢性腦缺血大鼠腦白質(zhì)損傷及認(rèn)知功能的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93（17）：1330-1334.

[8] Karkouti K，Beattie WS，Wijeysundera DN，et al.Hemodilution during cardiopulmonary bypass is an independent risk factor for acute renal failure in adult cardiac surgery[J].J Thorac Cardiovase Surg，2005，129（2）：391-400.

[9] Tsui AK，Dattani ND，Marsden PA，et al.Reassessing the risk of hemodilutional anemia：some new pieces to an old puzzle[J].Can J Anaesth，2010，57（8）：779-791.

[10] Dodds C，Allison J.Postoperative cognitive deficit in the elderly surgical patient[J].Br J Anaesth，1998，81（3）：499.

[11] Bekker AY，Weeks EJ.Cognitive function after anaesthesia in the eldrly[J].Best Pract Res Clin Anaesthesiol.2003，17（2）：259-272.

[12] Paul CM，Magda G，Abel S.Spatial memory：Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents[J].Behav Brain Res，2009，203（2）：151-164.

[13] Miki K，lshibashi S，Sun L，et al.Intensity of chronic cerebral hypoperfusion determines white／gray matter injury and cognitive／motor dysfunction in mice[J].J Neurosci Res，2009，87（5）：1270-1281.

[14] 尚游，袁世熒，姚尚龍.高滲氯化鈉羥乙基淀粉溶液對失血性休克兔應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2005，25（1）：37-39.

[15] 沈麗娟.老年人術(shù)后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)因素[J].醫(yī)學(xué)信息，2009，1（6）：1-3.