張 桃，謝 銘，賀新媛，楊雪峰

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義563000）

結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關(guān)，因此抑制腫瘤血管生成過程對于抗腫瘤研究有著重要意義。尋找高效、低毒、較少產(chǎn)生耐藥性的血管生成抑制劑是抗腫瘤血管生成治療的熱點(diǎn)之一。作為傳統(tǒng)中草藥龍葵，其提取物龍葵堿，近年來備受關(guān)注，龍葵堿在抗腫瘤方面已取得了較好的成果，但能否抑制人結(jié)腸癌誘導(dǎo)的血管生成，使腫瘤發(fā)展受到影響，至今無相關(guān)報道。因此設(shè)計本實(shí)驗觀察龍葵堿對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株移植瘤的血管生成的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞株由遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗室提供。實(shí)驗試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、南美胎牛血清、胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品。龍葵堿（純度95%）購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；明膠海綿由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院贈送。受精雞蛋購自廣東南雄養(yǎng)雞場，平均55～60g／個，全自動數(shù)顯型孵化機(jī)購自德州德興孵化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞生長于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5d傳代1次，實(shí)驗時采用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 雞胚孵育 將受精雞蛋予以高錳酸鉀液消毒后，氣室向上置于溫度為38.2℃、濕度60%的孵化機(jī)中孵育，每天翻蛋1次。

1.2.3 龍葵堿液的制備 將純度95%的龍葵堿5mg溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO）液中，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）999mL調(diào)整含龍葵堿的 DMSO，使DMSO液濃度在0.1%以下，抽取100mL含龍葵堿的PBS液分別溶于30、40、50mL的 PBS液，配置成劑量為150、200、250 μg／mL的龍葵堿，無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 明膠海綿制備 將明膠海綿剪成大小約0.5mm×0.5mm，無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 人結(jié)腸癌雞胚移植模型的建立

1.2.5.1 雞胚絨毛尿囊膜（CAM）制備 參照參考文獻(xiàn)[1]方法并加以改進(jìn)，在照蛋器下，選取孵育至9d生長較好的雞胚，距胎頭下方0.5～1.0cm處劃定開窗位置，其大小約1cm×1 cm，予75%乙醇消毒后置于超凈臺上，用無菌鋸片在雞胚上沿劃定的開窗大小輕輕劃開，用無菌眼科鑷沿開口打開蛋殼，用5mL的無菌注射器刺破卵殼膜，并加入無菌生理鹽水1滴后使卵殼膜與CAM分離，制造人工氣室后去除卵殼膜后暴露CAM。

1.2.5.2 HT-29細(xì)胞接種 取生長對數(shù)期的細(xì)胞，消化、離心，用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×106個／mL[2]，以制作好的明膠海綿為載體，取20μL HT-29細(xì)胞懸液接種于CAM相對無血管區(qū)域。用無菌封口膜封口，置于孵化機(jī)繼續(xù)孵育。

1.2.6 分組治療 將接種HT-29細(xì)胞的雞胚于繼續(xù)孵育后的第2天，分為對照組10個和實(shí)驗組（低、中、高劑量）各10個。實(shí)驗組去除封口膜后分別加入20μL，劑量為150、200、250μg／mL的龍葵堿，做好標(biāo)記；對照組給予等量的PBS。封口膜封口后繼續(xù)孵育5d，每天觀察雞胚的生長情況及血管特性。

1.2.7 固定取膜 給藥后第5天，用4%的甲醛溶液原位固定移植瘤15～20min，以接種區(qū)為中心用眼科鑷剪下CAM，平鋪于平皿中立體顯微鏡拍照，收集CAM上移植瘤血管圖片，用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，收集數(shù)據(jù)；取下的移植瘤進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用Envision二步法，檢測腫瘤組織的CD34抗原標(biāo)記的微血管密度（MVD）及ki-67抗原表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HT-29細(xì)胞移植后腫瘤新生血管的生成 接種HT-29細(xì)胞24h內(nèi)，細(xì)胞呈淡白色黏附于CAM接種區(qū)，除CAM上原有的正常血管外，未見明顯的血管變化。2d后接種區(qū)域的癌細(xì)胞開始聚集，并可見少量微細(xì)的血管向瘤體集中。3～5d后移植瘤迅速生長，直徑可達(dá)5mm，大量的新生血管接近腫瘤組織，呈放射狀，部分血管長入或跨越瘤體表面，排列紊亂，甚至原有的CAM上粗大血管也向移植瘤靠近，瘤體也由最初的蒼白色變成深褐色，部分瘤體表面有白色小點(diǎn)，同時雞胚活動明顯，見圖1。

表1 不同劑量的龍葵堿對微血管面積、MVD、ki-67抗原的影響（±s）

表1 不同劑量的龍葵堿對微血管面積、MVD、ki-67抗原的影響（±s）

a：P＜0.01，與對照組比較。

組別 微血管面積 MVD ki-67抗原低劑量 13.21±0.89a 24.45±3.86a 34.12±3.48a中劑量 11.53±0.82a 20.30±3.68a 28.24±3.33a高劑量 8.92±0.79a 16.40±3.51a 24.74±2.31a對照組22.91±1.45 37.83±4.03 58.75±4.29

2.2 龍葵堿對腫瘤微血管面積及ki-67抗原的作用 在實(shí)驗組中，應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件定量處理圖片和收集數(shù)據(jù)后，結(jié)果表明：不同給藥劑量的龍葵堿，CAM移植后腫瘤的微血管面積分別為（13.21±0.89）、（11.53±0.82）、（8.92±0.79），明顯低于對照組（22.91±1.45）（P＜0.01），其組間的微血管面積也有明顯差異（P＜0.01），見表1、圖2。

圖1 HT-29細(xì)胞移植后腫瘤新生血管的生成

圖2 不同劑量龍葵堿血管新生面積

圖3 不同劑量龍葵堿ki-67抗原表達(dá)

圖4 不同劑量龍葵堿CD34抗原表達(dá)

對移植瘤行HE染色后，光鏡下可見瘤體組織結(jié)構(gòu)與人結(jié)腸腺癌組織相似，表現(xiàn)為細(xì)胞分化差，異型性明顯，核分裂相常見。部分腫瘤組織形成類似腺管樣組織。免疫組織化學(xué)顯示隨著龍葵堿劑量的增加，腫瘤MVD也相應(yīng)降低，且具有劑量依賴性，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），明顯低于對照組（37.83±4.03）（P＜0.01），與微血管面積的降低程度相一致；ki-67抗原表達(dá)分別為（34.12±3.48）、（28.24±3.33）和（24.74±2.31），與龍葵堿劑量呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.789），同時低于對照組（58.75±4.29）（P＜0.01），且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1，圖3、4。

3 討 論

現(xiàn)有的臨床研究表明，中藥龍葵的提取物能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞膜通透性以及抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)等多種途徑達(dá)到抗腫瘤作用。Lin等[3]、高世勇等[4]研究發(fā)現(xiàn)龍葵提取物能增加Bcl-2相關(guān)X蛋白的表達(dá)、下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白，使B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白／Bcl-2相關(guān)X蛋白比值下降，激活caspase家族的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；也有文獻(xiàn)報道龍葵堿也可通過活化卡巴蛋白的表達(dá)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子傳導(dǎo)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]；同時研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿能顯著降低膜電位，開放線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道，使細(xì)胞外Ca2＋順濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi) Ca2＋升高啟動細(xì)胞凋亡機(jī)制[7]；季宇彬等[8]研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿能增加細(xì)胞內(nèi)α-微管蛋白，使細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)發(fā)生紊亂，細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的“正?！贝x。常樂等[9]研究表明龍葵多糖粗提物能使人胃癌 MGC-803細(xì)胞在G0／G1期和G2／M期的數(shù)量下降，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。聶巧珍等[10]研究表明激光照射聯(lián)合龍葵多糖能抑制細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致新生血管受到抑制，腫瘤組織增生程度減弱。但龍葵堿是否能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管發(fā)生與發(fā)展未見報道。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)將不同劑量的龍葵堿于接種HT-29細(xì)胞成活雞胚模型中2d后加入接種區(qū)域，3～5d后腫瘤組織與對照組相比較，周圍血管數(shù)明顯減少，腫瘤組織生長緩慢，且隨著龍葵堿的劑量增加，新生血管減少越顯著，表現(xiàn)為劑量依賴性。推測龍葵堿可能通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，改變內(nèi)皮細(xì)胞通透性，甚至引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，繼而使新生血管生成減少，腫瘤組織發(fā)生缺血壞死。龍葵堿對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腫瘤血管的生成是在宿主微血管床基礎(chǔ)上，由腫瘤組織誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移而產(chǎn)生管型血管的過程，也是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的必要條件。目前對雞胚尿囊膜新生血管面積的計數(shù)方法主要有：直接計數(shù)CAM上血管數(shù)目，另一個是應(yīng)用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件對圖片進(jìn)行分析，后者可靠程度高，避免了人為因素的影響而造成的誤差，本實(shí)驗用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件分析龍葵堿抑制人結(jié)腸癌誘導(dǎo)的CAM新生血管，發(fā)現(xiàn)不同給藥劑量的CAM上血管新生面積明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。證實(shí)了龍葵堿對腫瘤血管有著明顯的影響，可致腫瘤生長緩慢。

MVD與腫瘤組織分級、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為惡性腫瘤生物學(xué)行為的主要參數(shù)。目前諸多學(xué)者較多采用CD31、CD34或者Ⅷ因子抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用Weidner技術(shù)對標(biāo)記的細(xì)胞計數(shù)，進(jìn)而檢測MVD[11]。本研究發(fā)現(xiàn)龍葵堿組MVD值明顯低于對照組MVD（P＜0.01），且不同劑量間的MVD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示龍葵堿能降低腫瘤MVD值，抑制腫瘤組織生長，可影響腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

Ki-67抗原與腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)記的相關(guān)核抗原，主要分布于細(xì)胞核中，其作用與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)，不表達(dá)于細(xì)胞的G0期，S、G2期開始升高，在 M期達(dá)到高峰。研究顯示Ki-67蛋白表達(dá)對早期診斷結(jié)直腸癌有較高的價值[12]，其表達(dá)越高，顯示腫瘤組織惡性越高，但與結(jié)直腸癌組織是否有轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無相關(guān)性。結(jié)果表明Ki-67抗原可反映腫瘤組織增生情況，為研究抗腫瘤增殖提供重要依據(jù)。本研究結(jié)果表明，不同劑量的龍葵堿干擾HT-29細(xì)胞移植瘤中Ki-67抗原的表達(dá)明顯低于對照組，且隨著劑量的增加，低表達(dá)越顯著，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這現(xiàn)象是龍葵堿直接作用于瘤體組織，還是通過抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管而抗腫瘤作用，或者同時作用于二者，還待進(jìn)一步研究。同時在本實(shí)驗研究中發(fā)現(xiàn)，ki-67的免疫表達(dá)背景像更多的脂肪組織，染色較淺，這可能受雞胚活動的影響。

綜上所述，中藥龍葵的提取物龍葵堿能明顯抑制雞胚尿囊膜模型上人結(jié)腸癌誘導(dǎo)的微血管的生長，阻斷了腫瘤組織生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)，從而達(dá)到抗腫瘤增殖作用，為臨床指導(dǎo)龍葵堿治療腫瘤方面提供了新的依據(jù)。

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