譚小玉，侯長(zhǎng)春，陳俊健，黎 雨，劉唐娟，周鴻江

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院呼吸內(nèi)科，南寧530007）

慢性氣道炎癥是支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等慢性氣道疾病的核心病理生理學(xué)改變，IL-1β是已發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)和維持炎癥最主要的因子之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在哮喘患者的肺泡灌洗液和肺活檢標(biāo)本中顯著增高，支氣管上皮細(xì)胞是主要來(lái)源[2]，但I(xiàn)L-1參與氣道炎癥機(jī)制未完全明了。氣道上皮細(xì)胞在氣道及肺部固有免疫和獲得性免疫過(guò)程中扮演著重要角色，研究表明氣道上皮細(xì)胞可通過(guò)釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）等炎癥因子參與哮喘、COPD等慢性氣道疾病炎癥過(guò)程[3]。高遷移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB1）在內(nèi)毒素血癥作為晚期炎癥介質(zhì)發(fā)揮促炎作用，眾多研究也表明HMGB1參與多種局部性和全身性炎癥性疾病的炎癥過(guò)程[4-5]。有研究證明，HMGB1在哮喘和COPD患者誘導(dǎo)痰、肺活檢標(biāo)本中顯著增加，與肺功能?chē)?yán)重程度呈顯著正相關(guān)，表明HMGB1是參與慢性氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展一種重要炎癥介質(zhì)[6-7]。本研究探討IL-1β能否誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞的HMGB1表達(dá)和釋放，以增加對(duì)IL-1β參與慢性氣道疾病發(fā)病機(jī)制的理解，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選用 健康人支氣管上皮細(xì)胞（HBE）135-E6E7（美國(guó)ATCC，CRL-2741TM）；胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德公司）；Human HMGB1ELISA kit（ground biotechnology diagnosticate，USA）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng) HBE135-E6E7 用含10%胎牛血清，100U／mL青霉素，100μg／mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，80%～90%融合后，2～3d傳一代。HBE細(xì)胞胰酶消化后，按2.5×104個(gè)／cm2的密度傳至6孔板、24孔板、96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞刺激前24h換成角質(zhì)化無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別加入不同濃度IL-1β。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 傳至96孔板的HBE，加入0.1、1.0、10.0ng／mL不同濃度的IL-1β，同時(shí)以未加任何處理因素的HBE作為對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入濃度為5mg／mL的20μL MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，棄培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩儀振蕩至晶體顆粒溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm的吸光度值（A值），細(xì)胞活力＝（加IL-1β組A值-不加細(xì)胞組A值）／（不加IL-1β對(duì)照組A值-不加細(xì)胞組A值）×100%。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR） 采用異硫氰酸胍法提取總RNA。將IL-1β處理或?qū)φ盏腍BE（6孔板）加入TRIzol（invitrogen）1mL吹勻，然后經(jīng)過(guò)氯仿萃取，異丙醇沉淀，70%乙醇沖洗沉淀后，以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，以1μg總RNA為底物，加入20μL RT反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（按format；thermo scientific說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），-20℃凍存?zhèn)溆?。Real-time PCR反應(yīng)中所用的引物：HMGB1引物：上游：5′-TGT CCA CAC ACC CTG CAT ATT G-3′，下 游：5′-AAT CCC ATG GTG TGA CAG AAT GGA-3′，序列長(zhǎng)度為446bp；β-actin：上游5′-AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3′和下游5′-TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA-3′，序列長(zhǎng)度為324bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，95℃15s，60℃45s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。采用SYBR Premix EX Taq（Takana）熒光，整個(gè)RT-PCR過(guò)程在ABI 7900熒光定量PCR儀上完成，熒光信號(hào)使用SDS軟件分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫蛋白印跡檢測(cè)IL-1β刺激HBE總蛋白、胞核、胞漿HMGB1表達(dá) 按胞質(zhì)和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德公司）說(shuō)明書(shū)步驟提取胞質(zhì)胞核蛋白，簡(jiǎn)述如下：收集處理后的細(xì)胞，加入100μL預(yù)冷的緩沖液A[10mmol／L 4-羥乙基哌嗉乙磺酸（HEPES），pH 7.9；10mmol／L KCl；0.1mmol／L EDTA；0.1mmol／L 乙 二 酸 醇 雙 （2-氨 基 乙 基 醚 ）四 乙 醉（EGTA）；1mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）；0.5mmol／L 苯甲基磺酰氟（PMSF）]劇烈震蕩30s后，冰上靜置15min破壞細(xì)胞膜，2 000×g離心10min，上清液部分即為胞質(zhì)蛋白，沉淀，加入15μL預(yù)冷的緩沖液 B （20mmol／L HEPES，pH 7.9；0.4 mol／L NaCl；1mmol／L EDTA；1mmol／L EGTA；1mmol／L DTT；1mmol／L PMSF）冰上靜置30min，每隔5min劇烈振蕩1次，破壞核膜，4℃下15 000×g離心5min，上清液含核蛋白組分。BCA法蛋白質(zhì)定量置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)10%十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離1.5h、轉(zhuǎn)膜1.5h到硝酸纖維素膜（Pall公司）和5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，依次加入兔抗HMGB1，β-actin單克隆抗體（Abcam 1∶1 000）1%TBST 4℃過(guò)夜、辣根過(guò)氧化酶耦聯(lián)的兔抗羊 （中衫金橋，1∶6 000），ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Quantity One凝膠成像系統(tǒng)觀察分析條帶灰度值。

1.2.5 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中HMGB1 嚴(yán)格按照Human HMGB1ELISA Kit的說(shuō)明書(shū)操作。將50μL標(biāo)準(zhǔn)品和上清液加入抗體包被的96孔板內(nèi)，在上清液樣本孔中分別加入50μL酶標(biāo)記溶液后充分混勻；置于溫箱內(nèi)37℃孵育60min；用1×PBS手工洗板清洗5次；每孔各加50μL反應(yīng)液A和B；蓋起微孔板37℃孵育15min，每孔加50μL終止液終止反應(yīng)，30min后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度值（450nm），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液樣本蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 免疫熒光觀察IL-1β刺激后對(duì)HBE HMGB1的移位的影響 在支氣管上皮細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定15min，0.1%Triton-100處理10min，每片滴50μL 5%BSA封閉，37℃，30min；滴加 HMGB1一抗（1∶100稀釋?zhuān)?7℃，90min，PBS沖洗3次；避光滴加熒光二抗，37℃，60min，PBS沖洗；50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT比色法檢測(cè)不同濃度IL-1β對(duì)細(xì)胞活力的影響分別用0、0.1、1.0、10.0ng／mL濃度IL-1β刺激 HBE 24h，各組細(xì)胞活力分別為100.0%、95.6%、100.3%、105.2%（圖1）。與對(duì)照組比較，各濃度的IL-1β對(duì)HBE活力影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 不同濃度IL-1β對(duì)HBE細(xì)胞活力影響（n＝8）

圖2 IL-1β上調(diào)了HBE的HMGB1的mRNA表達(dá)水平

2.2 IL-1β對(duì)支氣管上皮細(xì)胞HMGB1mRNA和蛋白表達(dá)影響 支氣管上皮細(xì)胞組成性表達(dá)HMGB1，對(duì)照組HBE的HMGB1mRNA表達(dá)水平在18h最高（圖2）。IL-1β以濃度和時(shí)間依賴(lài)方式增加了HBE的HMGB1mRNA表達(dá)水平，最顯著的差異性發(fā)生在IL-1β10ng／mL刺激HBE 18h時(shí)，約為對(duì)照組2.5倍（2.78±0.08vs.1.35±0.04）。IL-1β0.1ng／mL只是在18h輕度增加了 HMGB1mRNA表達(dá)。IL-1β1.0、10.0ng／mL刺激HBE 24h，HBE的 HMGB1蛋白表達(dá)水平升高，IL-1β10ng／mL更明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 IL-1β上調(diào)了HBE的HMGB1的蛋白表達(dá)水平

圖4 ELISA檢測(cè)不同劑量IL-1β對(duì)HBE釋放HMGB1的影響

2.3 IL-1β對(duì)支氣管上皮細(xì)胞 HMGB1釋放的影響 0、0.1、1.0、10.0ng／mL IL-1β刺激 HBE 24h后上清液 HMGB1蛋白含量分別為（9.77±1.03）ng／mL及（18.90±1.34）ng／mL，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和0.1ng／mL IL-1β刺激組細(xì)胞上清液HMGB1含量低于試劑盒檢測(cè)下限。1.0ng／mL和10.0ng／mL IL-1β刺激HBE 24h后HMGB1蛋白含量明顯增加，10.0 ng／mL IL-1β更加顯著（P＜0.05），IL-1β對(duì) HBE HMGB1的釋放有劑量依賴(lài)性（圖4）。本研究也觀察了IL-1β影響HMGB1分泌釋放有時(shí)間依賴(lài)性，10.0ng／mL IL-1β刺激HBE 0、6、12h及24h后上清液中HMGB1蛋白含量分別為（11.60±0.83）ng／mL、（19.80±0.89）ng／mL，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)：10.0ng／mL IL-1β刺激支氣管上皮細(xì)胞6h后，細(xì)胞上清液中HMGB1含量無(wú)變化，而當(dāng)刺激時(shí)間延長(zhǎng)至12h和24 h，上清液中HMGB1含量明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 在不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β（10.0ng／mL）對(duì) HBE細(xì)胞培養(yǎng)上清液HMGB1水平的影響

2.4 IL-1β對(duì)HBE胞質(zhì)和胞核HMGB1含量影響 通過(guò)蛋白免疫印跡方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-1β（10.0ng／mL）刺激 HBE 24h后，發(fā)現(xiàn)胞核蛋白有減少，而細(xì)胞胞質(zhì)蛋白相應(yīng)明顯增加，這進(jìn)一步印證了IL-1β誘導(dǎo)了HBE的HMGB1的釋放（圖6）。免疫熒光發(fā)現(xiàn)HMGB1高豐度表達(dá)于未受刺激HBE的細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)IL-1β刺激HBE，HMGB1從胞核中轉(zhuǎn)位出來(lái)，見(jiàn)圖7。

圖6 IL-1β（10.0ng／mL）對(duì) HBE細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核HMGB1表達(dá)的影響

圖7 免疫熒光觀察IL-1β對(duì)HBE HMGB1表達(dá)及移位的影響

3 討 論

HMGB1在非應(yīng)激狀態(tài)下主要定位細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞因子、損傷等應(yīng)激狀態(tài)下，HMGB1可以被主動(dòng)釋放到胞外，發(fā)揮其胞外促炎癥等效應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞HMGB1的主動(dòng)釋放[8]。本研究在體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以濃度和時(shí)間依賴(lài)性地增加支氣管上皮細(xì)胞HMGB1表達(dá)，并促進(jìn)HMGB1從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位和主動(dòng)釋放到胞外。

研究證明IL-1β是啟動(dòng)和維持機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一[1]，是一種典型的多功能細(xì)胞因子。IL-1β可以促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞和組織細(xì)胞炎癥因子釋放，亦可以促進(jìn)骨髓修復(fù)，有利于癌癥治療。IL-1β在穩(wěn)定期COPD患者中產(chǎn)生增多，在COPD急性加重期進(jìn)一步升高[9]，IL-1β在哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肺泡灌洗液中表達(dá)也增加[2]。Lappalainen等[10]通過(guò)IL-1β轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型證明高表達(dá)IL-1β可以引起肺泡間隔擴(kuò)大、氣管壁增厚、黏液分泌增加、肺間質(zhì)纖維化等，這些符合支氣管哮喘和COPD病理學(xué)改變。初步揭示IL-1β誘導(dǎo)肺部這些病變與增加中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1、CXCL2和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9和MMP-12）有關(guān)，但是否存在其他機(jī)制尚不明確。

HMGB1是細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白染色質(zhì)蛋白，核內(nèi)主要參與穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能并協(xié)調(diào)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。HMGB1作為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）分子通過(guò)釋放到胞外發(fā)揮促炎癥作用成為近年來(lái)該分子研究的熱點(diǎn)[11]。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在各種外界刺激因素或應(yīng)激下HMGB1可以從細(xì)胞中釋放出來(lái)，促進(jìn)炎性反應(yīng)。在膿毒血癥和關(guān)節(jié)炎等炎癥過(guò)程中，HMGB1可以通過(guò)募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟等途徑參與促炎反應(yīng)[11]。

HMGB1在真核生物細(xì)胞核中廣泛高豐度表達(dá)，在肺部HMGB1被發(fā)現(xiàn)主要高表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞[12]，OVA致敏哮喘小鼠模型進(jìn)一步被證實(shí)HMGB1主要定位于支氣管上皮細(xì)胞[13]。這些結(jié)果高度提示支氣管上皮細(xì)胞是肺部HMGB1主要來(lái)源，這也是本研究選擇支氣管上皮細(xì)胞作為研究靶點(diǎn)的主要原因。本研究首先通過(guò)MTT法證實(shí)實(shí)驗(yàn)選用濃度的IL-1β對(duì)支氣管上皮細(xì)胞無(wú)毒性，而且IL-1β的劑量也接近于體內(nèi)生理量和哮喘、COPD患者肺內(nèi)表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β不僅能誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)，還可促進(jìn)HMGB1的轉(zhuǎn)位和主動(dòng)釋放，進(jìn)一步驗(yàn)證了氣道上皮細(xì)胞是作為DAMPs分子HMGB1的重要來(lái)源。本研究發(fā)現(xiàn)的IL-1β促進(jìn)HMGB1的主動(dòng)釋放類(lèi)似于既往的研究，均具有一定時(shí)間和濃度依賴(lài)性[8]。更重要的是，大量的研究證實(shí)HMGB1在哮喘和COPD、慢性肺源性心臟病發(fā)病中起作用，因而被誘導(dǎo)釋放HMGB1可能是IL-β介導(dǎo)慢性氣道炎癥的新機(jī)制之一[6-8，13-15]。IL-β不僅可以通過(guò)增加 CXCL1、CXCL2和基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)加劇氣道炎癥，通過(guò)誘導(dǎo)釋放HMGB1也可能是另一條重要途徑。

目前氣道上皮細(xì)胞HMGB1釋放的機(jī)制涉及相關(guān)的信號(hào)通路的活化尚不清楚，而釋放到局部氣道腔能否與IL-1β形成復(fù)合物也是值得探討的問(wèn)題，因?yàn)镠MGB1-IL-1β復(fù)合物促炎癥功能遠(yuǎn)大于單一的HMGB1或IL-1β。這些是本研究課題組接下來(lái)探討的方向，將進(jìn)一步研究。

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