崔躍 朱啟文 商麗宏 崔皓哲 徐暢

嗎啡依賴戒斷大鼠海馬區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)變化研究

崔躍 朱啟文 商麗宏 崔皓哲 徐暢

目的應(yīng)用在體電生理方法觀察嗎啡依賴戒斷后大鼠海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的變化情況。方法18只健康SD大鼠, 隨機(jī)分為嗎啡依賴組、戒斷組、鹽水對(duì)照組, 每組6只。建立大鼠嗎啡依賴戒斷模型, 在制備模型基礎(chǔ)上, 采用在體腦立體定位胞外電生理記錄技術(shù)檢測(cè)海馬CA1區(qū)LTP的變化情況。結(jié)果與對(duì)照組相比, 嗎啡依賴組、戒斷組大鼠在高頻刺激(HFS)后, 各時(shí)間點(diǎn)所記錄的群體峰電位(PS)相對(duì)幅值顯著降低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論嗎啡依賴戒斷大鼠海馬LTP減弱, 提示LTP參與嗎啡依賴戒斷過程。

嗎啡；依賴；戒斷；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

嗎啡是中樞鎮(zhèn)痛性藥物, 而且具有很強(qiáng)的成癮性, 長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡, 可產(chǎn)生強(qiáng)迫性藥物使用行為, 因此限制了其臨床應(yīng)用范圍。大量文獻(xiàn)表明, 嗎啡成癮的發(fā)生發(fā)展過程和經(jīng)典的學(xué)習(xí)記憶過程有眾多相似之處, 與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都參與了藥物依賴的形成和心理渴求[1,2]。研究認(rèn)為, 成癮相關(guān)記憶占據(jù)了正常學(xué)習(xí)記憶通路,導(dǎo)致病理性學(xué)習(xí)記憶對(duì)成癮的記憶[3]。另一方面, 嗎啡長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)能力, 如認(rèn)知能力等產(chǎn)生損害[4-6],可見嗎啡成癮與學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。

海馬在關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)過程中的作用非常重要, 海馬區(qū)LTP是某些記憶形式的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)的電生理指標(biāo), 海馬區(qū)LTP的誘導(dǎo)與保持和學(xué)習(xí)記憶過程有密切的關(guān)系, 被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)影響中樞學(xué)習(xí)與記憶功能藥物的藥理學(xué)研究[5,7],并已被認(rèn)為是成癮研究中的重要技術(shù)手段[8]。

本項(xiàng)研究通過建立大鼠嗎啡依賴和戒斷模型, 應(yīng)用在體腦立體定位胞外電生理記錄技術(shù), 在動(dòng)物整體水平上觀測(cè)嗎啡依賴戒斷大鼠對(duì)海馬CA1區(qū)LTP的影響, 并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠, 體重200 ～260 g；鹽酸嗎啡, 青海制藥廠；納洛酮(Sigma, 美國)；氨基甲酸乙酯(烏拉坦),北京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備18只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組, 共三組：?jiǎn)岱纫蕾嚱M、戒斷組、鹽水對(duì)照組, 每組6只。參照文獻(xiàn)[9,10]建立慢性大鼠嗎啡依賴模型：大鼠腹腔內(nèi)注射鹽酸嗎啡, 首次劑量為10 mg/kg,2次/d(8：00,16：00), 接下來的嗎啡劑量每日增加10 mg/kg, 一共注射7 d, 其中第6、7天的注射劑量保持在50 mg/kg, 于第7天早8：00注射嗎啡50 mg/kg1次, 建成嗎啡依賴模型。鹽水對(duì)照組每次腹腔注射相等量的的生理鹽水。參照文獻(xiàn)[11,12]建立納洛酮誘發(fā)戒斷模型, 于第7天嗎啡注射2 h后, 戒斷組腹腔注射納洛酮(4 mg/kg)進(jìn)行急性催促戒斷, 從而建立嗎啡戒斷模型。

1.2.2 CA1區(qū)LTP的測(cè)量 電極埋植方法：應(yīng)用20%烏拉坦(0.75 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠, 并將其固定在腦立體定位儀上。在顱骨表面相應(yīng)位置鉆兩個(gè)直徑約3 mm左右的孔, 用于埋植電極, 記錄電極位置(AP3.4 mm、L或R2.5 mm、H2.4～3.0 mm), 刺激電極位置(AP4.2 mm、L或R3.8 mm、H2.4～3.0 mm)。在立體定位儀上根據(jù)圖譜, 按照相應(yīng)的坐標(biāo)調(diào)整兩個(gè)電極的適宜位置, 當(dāng)應(yīng)用固定強(qiáng)度的刺激可以記錄到最大群體峰電位(population spike, PS)時(shí)將電極固定好。PS記錄及幅值計(jì)算方法：海馬CA1區(qū)細(xì)胞興奮性的指標(biāo)用PS幅值來表示。PS記錄采用細(xì)胞外記錄。測(cè)試刺激是單個(gè)電脈沖, 波寬為0.2 ms, 每次間隔為15 s, 強(qiáng)度為引起最大群體電位的50%。由電子刺激器產(chǎn)生, 經(jīng)隔離器和刺激電極輸出。高頻刺激(high frequency stimulation, HFS)參數(shù)：頻率100 Hz、波寬0.2 ms, 共4串刺激, 每串含有50個(gè)刺激, 每串刺激間隔為10 s, 刺激強(qiáng)度大小為誘導(dǎo)電位最大值的75%所對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度。高頻刺激后再用上述的單個(gè)刺激進(jìn)行檢測(cè), 并觀察持續(xù)時(shí)間, 并且測(cè)量PS幅值及峰潛伏期, PS幅值增大超過20%并持續(xù)30 min以上可以視為產(chǎn)生了LTP。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 對(duì)記錄部位進(jìn)行組織學(xué)鑒定, 符合要求的資料納入統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡依賴戒斷大鼠模型戒斷癥狀評(píng)分結(jié)果 通過對(duì)大鼠納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀的實(shí)驗(yàn)記錄, 觀察到嗎啡依賴大鼠催促戒斷后出現(xiàn)明顯的齒顫、濕狗樣抖動(dòng)、跳躍、腹瀉、流涎、體質(zhì)量下降等戒斷癥狀。戒斷癥狀45 min的 Gellert-Holtzman 評(píng)分結(jié)果為：戒斷組(27.39±0.79)分、鹽水對(duì)照組(2.29±0.91)分。與鹽水對(duì)照組比較, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), 表明嗎啡依賴大鼠模型制備成功。

2.2 嗎啡戒斷對(duì)海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響 在高頻刺激后, 鹽水對(duì)照組大鼠的PS幅值明顯增強(qiáng), 幅值平均增加到刺激前的(153.56±7.83)%, 并且維持4 h無明顯減弱。高頻刺激后, 戒斷組大鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo)受到明顯抑制, 幅值平均增加到刺激前的(119.87±8.11)%, 與鹽水對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 見圖1。結(jié)果表明, 嗎啡戒斷后抑制高頻刺激后的突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。

圖1 嗎啡戒斷組突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的變化情況

3 討論

長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡, 可以使機(jī)體產(chǎn)生依賴性, 如果突然中斷外源性嗎啡的應(yīng)用, 機(jī)體會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源性阿片樣肽的絕對(duì)不足,進(jìn)而出現(xiàn)一系列機(jī)體的功能紊亂, 表現(xiàn)為多個(gè)系統(tǒng)的嚴(yán)重戒斷癥狀, 如煩躁不安、焦慮、抑郁等[13]。此次實(shí)驗(yàn)也觀察到,嗎啡依賴戒斷大鼠出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀。

眾多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明, 海馬腦區(qū)突觸傳遞的LTP是學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)之一[7,14,15], 海馬腦區(qū)LTP的改變是其突觸可塑性的具體表現(xiàn)之一。海馬突觸可塑性的改變是參與藥物成癮復(fù)吸的中樞機(jī)制之一[16]。本研究觀察到, 嗎啡戒斷明顯抑制LTP的誘導(dǎo), 提示戒斷組大鼠海馬腦區(qū)的突觸傳遞效能受到抑制。阿片類物質(zhì)在體內(nèi)代謝快, 但是長(zhǎng)期應(yīng)用后, 其與機(jī)體的相互作用會(huì)引起一系列適應(yīng)性改變。有研究表明, 慢性嗎啡處理后, μ-阿片受體數(shù)量減少達(dá)50%左右[17], μ-阿片受體下調(diào)的改變, 可能是嗎啡長(zhǎng)期應(yīng)用后使神經(jīng)元反應(yīng)性降低的原因之一。

總之, 本研究中, 觀察到μ-阿片受體抑制劑納洛酮應(yīng)用后, 可以抑制海馬腦區(qū)LTP, 此結(jié)果表明阿片肽系統(tǒng)在非NMDA受體依賴性LTP的形成中起到重要的作用。藥物成癮與突觸可塑性之間的關(guān)系異常復(fù)雜。藥物成癮是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的神經(jīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)心理學(xué)和社會(huì)學(xué)問題。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

[1]肖琳, 隋南.成癮行為形成過程中學(xué)習(xí)記憶的參與及其相關(guān)的腦機(jī)制.中國神經(jīng)科學(xué)雜志,2003,19(1):50.

[2]Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu Rev Neurosci,2006 (29):565-598.

[3]陳潔, 時(shí)杰.記憶晚期鞏固過程的研究進(jìn)展.中國藥物依賴性雜志,2014,23(3):161-165.

[4]Pu L, Bao GB, Xu NJ, et al. Hippocampal long-term potentiation is reduced by chronic opiate treatment and can be restored by reexposure to opiates. J Neurosci,2002,22(5):1914-1921.

[5]Salmanzadeh F, Fathollahi Y, Semnanian S, et al. Long-term potentiation as an electrophysiological assay for morphine dependence and withdrawal in rats: an in vitro study. J Neurosci Methods,2003,124(2):189-196.

[6]Salmanzadeh F, Fathollahi Y, Semnanian S, et al. Dependence on morphine impairs the induction of long-term potentiation in the CA1 region of rat hippocampal slices. Brain Res,2003,965(1-2):108-113.

[7]Bliss TV, Collingridge GL. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature,1993,361 (6407):31-39.

[8]Ungless MA, Whistler JL, Malenka RC, et al. Single cocaine exposure in vivo induces long-term potentiation in dopamine neurons. Nature,2001,411(6837):583-587.

[9]Chou WB, Zeng YM, Duan SM, et al. M2 muscarinic receptor of spinal cord mediated increase of nNOS expression in locus coeruleus during morphine withdrawal. Acta Pharmacol Sin,2002,23(8):691-697.

[10]Valverde O, Roques BP. Cholecystokinin modulates the aversive component of morphine withdrawal syndrome in rats. Neurosci Lett,1998,244(1):37-40.

[11]Busquets X, Ventayol P, García-Sevilla JA. Naloxone-precipitated withdrawal in morphine-dependent rats increases the expression of alpha2a-adrenoceptor mRNA in brain. Brain Res Mol Brain Res,1997,45(1):154-158.

[12]Aricioglu-Kartal F, Kayir H, Tayfun Uzbay I. Effects of harman and harmine on naloxone-precipitated withdrawal syndrome in morphine-dependent rats. Life Sci,2003,73(18):2363-2371.

[13]關(guān)新民.醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社,2002:540.

[14]Malenka RC, Nicoll RA. Long-term potentiation-a decade of progress? Science,1999 (285):1870-1874.

[15]Martin SJ, Grimwood PD, Morris RG. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci,2000(23):649-711.

[16]Vorel SR, Liu X, Hayes RJ, Relapse to cocaine-seeking after hippocampal theta burst stimulation. Science,2001(292):1175-1178.

[17]Bernstein MA, Weleh SP. μ-opioid receptor down regulation and cAMP-dependent protein kinase phosphorylation in a mouse model of chronic morphine tolerance. Mol Brain Res,1998(55):237.

Research of long-term potentiation changes in hippocampal region of rats with morphine dependence withdrawal

CUI Yue, ZHU Qi-wen, SHANG Li-hong, et al. Teaching and Research Office of Physiology, School of Basic Medicine of Shenyang Medical College, Shenyang110034, China

ObjectiveTo investigate the changes of long-term potentiation (LTP) in hippocampal CA1 region of rats with morphine dependence withdrawal.MethodsA total of18 healthy SD rats were randomly divided into morphine dependence group, withdrawal group, and saline water control group, and each group contained6 rats. Model of morphine dependence withdrawal rats was established. On the basis of model, changes of LTP in hippocampal CA1 region were detected by brain stereotaxic cell electric physical recording technique.ResultsCompared with the control group, rats in morphine dependence group and withdrawal group had significantly reduced population spike (PS) after high frequency stimulation (HFS). Their difference had statistical significance (P＜0.05).ConclusionReduced LTP in hippocampal region of rats shows that LTP is involved in process of morphine dependence withdrawal.

Morphine; Dependence; Withdrawal; Long-term potentiation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.09.191

2014-12-12]

國家自然科學(xué)基金資助(項(xiàng)目編號(hào)：81441110)；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：L2014405)；沈陽醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(項(xiàng)目編號(hào)：20133049)

110034 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室(崔躍 朱啟文), 實(shí)驗(yàn)室(商麗宏)；基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)(崔皓哲 徐暢)