王天琳，郭代紅，柴 棟，張 波，王 睿（.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 0085；.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 006；.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 0085）

利奈唑胺對人血小板細(xì)胞的凋亡作用研究

王天琳1，郭代紅1，柴 棟1，張 波2，王 睿3
（1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；3.解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，北京 100853）

[摘要]目的：研究利奈唑胺對人血小板的凋亡作用。方法：用兩步離心法制備人富血小板血漿并純化血小板，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測乳酸脫氫酶（LDH）評價血小板損傷程度，用Annexin V法檢測磷酯酰絲氨酸外翻，用比色法檢測Caspase-3活性。結(jié)果：與空白對照組相比，利奈唑胺劑給藥4 h可劑量依賴性引起磷酯酰絲氨酸外翻增加，Caspase-3活性增加。150 μg·mL-1利奈唑胺給藥4 h可引起血小板LDH釋放增加。結(jié)論：利奈唑胺可引起人血小板凋亡。

[關(guān)鍵詞]利奈唑胺；血小板；凋亡；乳酸脫氫酶；Caspase-3

Effect of linezolid on the apoptosis of human platelet in vitro

WANG Tian-lin1, GUO Dai-hong1, CHAI Dong1, ZHANG Bo2, WANG Rui3
(1. Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. School of Life Sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 3. Translational Medical Center, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT] Objective: To study the effect of linezolid on the apoptosis of human platelet. Methods: Two-step centrifugation was used for platelet enrichment and purification. LDH concentration in the supernatant was determined by ELISA, phosphatidylserine (PS) exposure by Annexin V-binding, and the activation of Caspase-3 by colorimetry. Results: Four hours exposure to linezolid triggered Annexin V-binding, activated Caspase-3 in dose dependent manner. Linezolid 150 μg·mL-1·4 h-1can stimulate the release of LDH. Conclusion: Linezolid can induce the apoptosis of human platelet.

[KEY WORDS] Linezolid; Platelet; Apoptosis; Lactic dehydrogenase; Caspase-3

利奈唑胺（linezolid）是第一個應(yīng)用于臨床的新型唑烷酮類抗生素[1]。其抗革蘭陽性球菌活性優(yōu)越，作為治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素糞腸球菌（VRE）感染的首選藥物[2]，利奈唑胺引起血小板減少的報(bào)道逐漸增多，嚴(yán)重限制其使用效能并影響患者預(yù)后[3]。近年來，多種藥物引起的血小板減少被報(bào)道與引起血小板凋亡有關(guān)，控制血小板凋亡有可能成為預(yù)防和治療血小板減少癥的新途徑?；诖?，本文嘗試考察不同濃度的利奈唑胺作用于人血小板細(xì)胞，觀察其是否具有誘導(dǎo)血小板凋亡的作用，為了解利奈唑胺引起血小板減少癥的相關(guān)機(jī)制，尋求降低該不良反應(yīng)發(fā)生率的對策，進(jìn)而提高利奈唑胺使用的安全性提供參考。

1　材料

1.1血小板

依據(jù)年齡30歲以下、無基礎(chǔ)性疾病、3個月內(nèi)未使用過任何藥物、無吸煙飲酒等不良嗜好，血小板基礎(chǔ)值在100×109·L-1至300×109·L-1區(qū)間范圍內(nèi)的納入條件選擇健康志愿者8名，簽署知情同意書，按“2.1”項(xiàng)下的方法獲取血小板。本研究已通過解放軍總醫(yī)院倫理委員會審議批準(zhǔn)（編號2012007）。

1.2試劑

利奈唑胺注射液（300 mL : 0.6 g）購自美國輝瑞制藥有限公司。細(xì)胞LDH檢測試劑盒（微孔法）、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，Caspase-3活性檢測試劑盒、伊屋諾霉素（Ionomycin）購自海門碧云天生物技術(shù)研究所，CGS緩沖液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液購自北京中生瑞泰科技有限公司。

1.3儀器

流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），電泳儀（美國BIO-RAD公司），搖床振蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），漩渦震蕩儀（海門其林貝爾儀器制造有限公司），DualRange分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司），酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）。

2　方法

2.1血小板富集與分離

于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日取每名志愿者靜脈血10 mL，將全血和ACD抗凝劑按照7 : 1體積輕輕混勻，在25 ℃下以800 r·min-1離心10 min，分離上層富含血小板血漿（PRP），再將PRP以1500 g離心2 min，棄上清液，沉淀用CGS緩沖液懸浮，在25 ℃下以2500 r·min-1離心2 min，棄上清液，將沉淀再重懸于CGS緩沖液洗滌，再次在25 ℃下以2500 r·min-1離心2 min，將沉淀部分用MTB緩沖液重懸，得到洗滌血小板，調(diào)整血小板濃度為3×108·mL-1，室溫靜置1 h 使其恢復(fù)至靜息狀態(tài)待用。

2.2分組

按照給藥劑量將洗滌后的血小板分為4組：空白對照組，利奈唑胺75 μg·mL-1組，利奈唑胺150 μg·mL-1組和Ionomycin 0.5 μmol組，每組8個樣本。

2.3乳酸脫氫酶活性檢測

將各組血小板在37 ℃下孵育4 h，期間在培養(yǎng)液中加入1% Triton X-100充分裂解血小板，取標(biāo)準(zhǔn)品丙酮酸鈉和樣本各10 μL加入到微孔板中。按說明書要求設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和對照孔，取60 μL底物緩沖液與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）混合溶液加到各孔，充分混勻，37 ℃水浴孵育15 min。而后在各孔中加入2，4-二硝基苯肼溶液50 μL，充分混合，37 ℃水浴孵育15 min后加入150 μL終止試劑。室溫靜置3 min，選擇450 nm波長進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀在440 nm波長處檢測各組吸光度。依據(jù)說明書公式算出LDH活性釋放量。

2.4磷脂酰絲氨酸外翻檢測

將各組血小板在37 ℃下孵育4 h。而后用PBS洗滌兩次（2000 r·min-1離心5 min），收集5×105個血小板，加入500 μL的Binding Buffer使之懸浮，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）混勻后，加入5 μL熒光染料碘化嘧啶再次混勻，在室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

2.5Caspase-3活性檢測

用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組樣品蛋白含量，確保蛋白濃度> 1 mg·mL-1。將各組血小板按說明書要求在37 ℃下孵育4 h。而后在4 ℃下600 g離心5 min收集血小板，除去上清液，用PBS洗滌一次后，加入1% Triton X-100充分裂解血小板，4 ℃下20 000 g離心10 ~ 15 min，立即在405 nm下測定pNA吸光度以反映Caspase-3的酶活性。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（x± s ）表示，單因素方差分析來確定多組樣本之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1利奈唑胺對人血小板乳酸脫氫酶釋放的影響

如圖1所示，150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h可引起人血小板LDH釋放增加，與空白對照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比均有明顯差異，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，人血小板LDH釋放未見顯著變化。

圖1　利奈唑胺對人血小板乳酸脫氫酶釋放的影響Fig 1 Effect of linezolid on LDH release of human platelets

3.2利奈唑胺對人血小板磷酯酰絲氨酸外翻的影響

如圖2所示，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞膜表面磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻顯著增加，與Annexin V特異性結(jié)合后產(chǎn)生綠色熒光，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，與空白對照組相比具有顯著性差異。150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞膜表面PS外翻顯著增加，與空白對照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比均具有顯著性差異。

3.3利奈唑胺對人血小板Caspase-3酶活性的影響

如圖3所示，150 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞Caspase-3酶活性顯著升高，與空白對照組、利奈唑胺75 μg·mL-1組相比具有顯著性差異。與空白對照組相比，75 μg·mL-1利奈唑胺作用4 h，血小板細(xì)胞Caspase-3酶活性未見顯著性變化。

圖2　利奈唑胺對人血小板磷酯酰絲氨酸外翻的影響Fig 2 Effect of linezolid on phosphatidylserine exposure of human platelets

圖3　利奈唑胺對人血小板Caspase-3酶活性的影響Fig 3 Effect of linezolid on Caspase-3 activity of human platelets

4　討論

近年來，多種因素引起的血小板減少癥均被報(bào)道與誘導(dǎo)血小板凋亡有關(guān)[4-6]。因此，本文依據(jù)利奈唑胺常用給藥劑量（600 mg，bid）下的藥-時曲線面積（AUC），設(shè)置了75 μg·mL-1、150 μg·mL-1兩個給藥劑量，模擬半衰期（t1/2）設(shè)置了4 h的給藥時間，擬觀察利奈唑胺是否存在對人血小板的凋亡作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利奈唑胺可劑量依賴性引起血小板PS外翻增加，150 μg·mL-1利奈唑胺可引起血小板LDH釋放增加，Caspase-3酶活性增加。提示利奈唑胺具有引起人血小板損傷的作用，且該作用可能與通過誘導(dǎo)血小板凋亡有關(guān)。

LDH來源于細(xì)胞內(nèi)，通過催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應(yīng)形成具有紫外吸收的產(chǎn)物而被檢測到[7]，其大量增加提示150 μg·mL-1利奈唑胺可引起血小板細(xì)胞膜的損傷。Annexin V可特異性地與外翻到細(xì)胞表面的PS結(jié)合，是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一[8]。有文獻(xiàn)指出，外翻的PS參與巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的結(jié)合，加快吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的清除[9]。利奈唑胺劑量依賴性引起人血小板PS外翻，除提示血小板處于早期凋亡狀態(tài)外，還存在通過誘導(dǎo)PS外翻，增加凋亡血小板的免疫原性，加快吞噬細(xì)胞對凋亡血小板的清除作用，進(jìn)而引起血小板減少。

Ionomycin是一種鈣離子載體，可開放細(xì)胞鈣離子通道，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。與Ionomycin相比，利奈唑胺誘導(dǎo)凋亡的作用部分類似，提示利奈唑胺具有潛在的鈣離子通道載體作用，尚需進(jìn)一步考察血小板細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化予以證實(shí)。

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收稿日期：（2015-03-08 修回日期：2015-06-21）

[作者簡介]王天琳，男，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)工作。E-mail：klezmer@126.com

[通信作者]王睿，女，研究員，主要從事臨床藥理學(xué)工作。E-mail：wangr_301@163.com

[基金項(xiàng)目]十二五國家重大科技專項(xiàng)（2012ZX09303004-002）

[中圖分類號]R977.1+5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672 – 8157(2015)04 – 0209 – 03