王 梅，常占瑛，侯艷霞，高曉黎（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

黃體酮凝膠劑的制備及藥效測定

王 梅，常占瑛，侯艷霞，高曉黎
（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

[摘要]目的：制備黃體酮凝膠劑，并初步考察黃體酮凝膠劑的藥效。方法：進(jìn)行黃體酮凝膠劑的處方優(yōu)化，選用卡波姆-940為凝膠劑的基質(zhì)，通過正交試驗，以黏度、屈服值和觸變性為指標(biāo)，篩選天然黃體酮凝膠劑的最佳處方。在此基礎(chǔ)上，采用兔子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實驗考察兔子宮分級指數(shù)、子宮增重指數(shù)和子宮腺體數(shù)，以考察黃體酮凝膠劑的藥效。結(jié)果：通過處方優(yōu)化制備的黃體酮凝膠劑外觀乳白色，粒徑分布均勻，黏度適中。藥效學(xué)結(jié)果表明，經(jīng)過23 d給藥，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組兔體質(zhì)量均有明顯增加，子宮指數(shù)逐漸升高，子宮分級結(jié)果空白基質(zhì)組，陽性對照組，低、中、高劑量組分別為（0.30±0.46）、（3.20±0.27）、（1.00±0.61）、（1.80±0.50）、（2.30±0.50），低、中、高劑量組較空白基質(zhì)組子宮腺體數(shù)目增加，但增加不及陽性對照組顯著。結(jié)論：黃體酮凝膠劑的制備方法可行，給藥后黃體酮凝膠劑具有一定的孕激素活性，能促進(jìn)兔子宮內(nèi)膜發(fā)育，表明該劑型具有一定的可行性。

[關(guān)鍵詞]黃體酮；凝膠劑；制備；藥效

Preparation and pharmacodynamics determination of progesterone gels

WANG Mei, CHANG Zhan-ying, HOU Yan-xia, GAO Xiao-li
(College of Pharmacy in Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

[ABSTRACT] Objective: To prepare progesterone gel and study its pharmacodynamics. Methods: Carbomer-940 was chosen as gel matrix, and the best preparation method was optimized through single factor and orthogonal test with viscosity, yield value and thixotropy as indicators. And the initial pharmacodynamics of progesterone gel was studied. The uterus grading number, uterus weight index and gland amounts were all measured by endometrial transformation experiment in rabbits. Results: The best preparation method of progesterone gel was decided, and a good progesterone gel with milky appearance, uniform particle size distribution, and moderate viscosity was made. In the initial pharmacodynamical study, the weight of the rabbits in control matrix group, low, middle and high dose group increased, the uterus grading number in control matrix group, positive control group, low, middle and high dose group was (0.30 ± 0.46), (3.20 ± 0.27), (1.00 ± 0.61), (1.80 ± 0.50), (2.30 ± 0.50) respectively. The uterus index and grading number improved. The uterine gland amounts in low, middle and high dose group were more than that in control matrix group, but the increase was not significant compared with positive control group. Conclusion: The preparation method about progesterone gel is feasible with well product quality and high effect on uterus of rabbits, which indicates progesterone can be made into gel through our method.

[KEY WORDS] Progesterone; Gel; Preparation; Pharmacodynamics

女性更年期綜合征是由于女性體內(nèi)雌激素缺乏，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的不平衡，使生理活動失調(diào)，從而引發(fā)潮熱、出汗、煩躁、焦慮、失眠、抑郁、記憶力減退、骨質(zhì)疏松、泌尿生殖道萎縮和心血管疾病等一系列癥狀，為了緩解這些癥狀，給予小劑量補充雌激素的方法被稱為激素補充療法（hormone replacement therapy，HRT）。黃體酮在婦科疾病中應(yīng)用廣泛，特別在激素補充療法中與雌激素合用，可有效避免雌激素帶來的副作用[1]。天然黃體酮與合成孕激素相比，副作用更小，但其口服吸收差，首過效應(yīng)強，在臨床上常用肌肉注射給藥，而黃體酮注射劑是油溶液，注射后疼痛，且黃體酮在HRT中需要長期給藥，肌注的給藥方式使得患者順應(yīng)性降低，所以提高黃體酮的生物利用度[2-3]，已成為黃體酮應(yīng)用中的關(guān)鍵問題。將天然黃體酮制成凝膠劑，可有效地避免黃體酮的首過效應(yīng)，利用“首過子宮效應(yīng)”，提高黃體酮在子宮內(nèi)的濃度，更好地發(fā)揮黃體酮的治療作用[4]。為此本課題組將天然黃體酮制成陰道用凝膠劑，并進(jìn)行黃體酮凝膠劑的處方優(yōu)化，在考察了黃體酮凝膠劑用藥后的陰道刺激性的基礎(chǔ)上[3]，本文進(jìn)一步考察了黃體酮凝膠劑的藥效作用。

1　實驗材料

1.1儀器與試劑

SPD-10AVP型高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP二元高壓泵，SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津公司）；AB135-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；WP-UP-IV-10型實驗室專用超純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；PB-10 pH計（德國Sartorius公司）、NDJ-8S旋轉(zhuǎn)式黏度計（上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司）；BS110S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

黃體酮對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號100027-200907）；黃體酮原料藥（湖北巨勝科技有限公司，批號20111027）；黃體酮注射劑（浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格1 mg : 10 mL，批號130217）；卡波姆、無水乙醇、氮酮、丙三醇、三乙醇胺、尼泊金乙酯、10%甲醛溶液均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物

雌性新西蘭未成熟白兔40只，體質(zhì)量0.8 ~ 1.2 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（新）2011-0003。

2　方法[5-8]

2.1黃體酮凝膠劑的制備

采用卡波姆-940作為基質(zhì)，甘油為保濕劑，無水乙醇為溶劑，氮酮為促透劑，吐溫-80為增溶劑，尼泊金乙酯為防腐劑，以黃體酮最大加入量溶解于溶劑后，與基質(zhì)攪拌均勻即得黃體酮凝膠劑。

2.1.1正交試驗優(yōu)化黃體酮凝膠劑處方 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定對黃體酮凝膠劑的成型工藝影響較大的因素，以形成凝膠的黏度、屈服值、觸變性作為指標(biāo)，采用正交試驗法，篩選最佳處方。

2.1.2凝膠基質(zhì)黏度的測定 參照黏度計測定法，在室溫下，用NDJ-8S旋轉(zhuǎn)式黏度劑測定形成的凝膠劑的黏度。

2.1.3凝膠基質(zhì)觸變性的測定 取黃體酮凝膠基質(zhì)適量，依次調(diào)整旋轉(zhuǎn)黏度計的轉(zhuǎn)速，使其增大，記錄各轉(zhuǎn)速下的數(shù)值；靜置基質(zhì)10 min，再依次調(diào)整旋轉(zhuǎn)黏度計的轉(zhuǎn)速使其減小，記錄各轉(zhuǎn)速下的數(shù)值；依照假塑性流體公式D=Sn/ηn（D：切變速度，ηn：表觀黏度隨切變速度的改變而改變，Sn：切變應(yīng)力）計算切變應(yīng)力；以Sn為橫軸，以D為縱軸繪制假塑性流體的流動曲線；計算基質(zhì)流動曲線中上升曲線和下降曲線之間所夾的面積，即為觸變性。

2.1.4凝膠基質(zhì)屈服值的測定 將流變曲線中下降曲線的直線部分延長，與橫軸的交點，記為屈服值（S0）。

2.2黃體酮凝膠劑藥效學(xué)實驗

在測定黃體酮凝膠劑的急性毒性基礎(chǔ)上，采用兔子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化試驗[9-11]，測定兔子宮內(nèi)膜腺體增生程度。將雌性新西蘭未成熟白兔40只，隨機分為空白基質(zhì)組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各8只。給藥劑量按臨床黃體酮人用劑量2倍，再按照黃體酮凝膠劑中黃體酮含量和兔體質(zhì)量，推算至每只兔應(yīng)給予的黃體酮凝膠量，則低劑量組黃體酮凝膠給予量為3.45 mg·kg-1、中劑量組為6.90 mg·kg-1、高劑量組為13.80 mg·kg-1，空白基質(zhì)組按6.90 mg·kg-1給予不含藥的空白凝膠劑，陽性對照組以黃體酮注射液作為陽性對照，按13.80 mg·kg-1肌肉注射給藥，空白基質(zhì)組、低劑量組、中劑量組和高劑量組連續(xù)陰道給藥23 d，第1天、23天分別稱重，第24天處死。陽性對照組連續(xù)給藥10 d，第11天稱重后處死。兔處死后，取部分子宮組織（自子宮與陰道連接處向卵巢方向用直尺量2 cm處），將取下的子宮稱重，然后剪開平鋪于濾紙上，吸干水分，置于10%甲醇溶液中固定24 h，做病理切片檢查。按兔子宮分級標(biāo)準(zhǔn)[12]對各組兔病理切片結(jié)果進(jìn)行分級。用子宮重量除以每只兔體質(zhì)量，計算子宮指數(shù)。

2.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，正交試驗采用方差分析，藥效學(xué)實驗結(jié)果采用q檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1正交試驗優(yōu)化黃體酮凝膠劑處方

以單因素試驗結(jié)果確定對凝膠形成影響最大的因素，設(shè)計因素水平表，見表1。

表1　因素水平表Tab 1 Factors and levels

采用L9（34）正交試驗設(shè)計表，按正交試驗表安排試驗（每次試驗重復(fù)3次）制備相應(yīng)的凝膠劑，以室溫黏度、屈服值、觸變性為指標(biāo)，綜合評分優(yōu)選成型工藝，權(quán)重系數(shù)分別為4∶3∶3。綜合評分公式如下：綜合評分=黏度/最大黏度值×40+ 屈服值/最大屈服值×30+ 觸變性/最大觸變性×30。詳見表2。

表2　正交設(shè)計表L9（34）Tab 2 The design of L9(34) orthogonal experiments

對結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。方差分析結(jié)果表明卡波姆的用量對制備工藝有顯著影響，而甘油和無水乙醇的用量無顯著性影響。結(jié)合單因素結(jié)果和實際考慮，最終確定處方為A3B2C3，即基質(zhì)中含0.25%卡波姆，15%甘油，25%無水乙醇。據(jù)此條件進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見表4。

表3　方差分析Tab 3 Analysis of variance

表4　驗證試驗Tab 4 Validation test

最后確定黃體酮凝膠劑的制備方法為：稱取卡波姆0.4 g，甘油10 g，無水乙醇10 g，蒸餾水10 g，攪拌均勻后放置過夜，加入1 g黃體酮（占凝膠劑總量的0.3%，g/g），攪拌均勻，依次再加入氮酮2 g，吐溫-80 1 g，蒸餾水加至100 g，充分?jǐn)嚢韬蠹尤脒m量的三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6 ~ 7，加入0.1 g尼泊金乙酯攪拌均勻即得。

3.2黃體酮凝膠劑藥效學(xué)實驗結(jié)果

黃體酮凝膠劑的急性毒性試驗結(jié)果表明，以最大給藥量20 mg·kg-1給予家兔，給藥后觀察7 d，家兔均無死亡，精神活動情況良好，可初步判斷黃體酮凝膠劑毒性小，最大耐受量在20 mg·kg-1以上。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行黃體酮凝膠劑的藥效學(xué)實驗，經(jīng)過23 d給藥，各組幼兔的體質(zhì)量變化結(jié)果見表5，子宮指數(shù)、子宮分級和腺體數(shù)結(jié)果見表6。

表5　兔體質(zhì)量變化結(jié)果. kg,±s, n=8Tab 5 Change of body weight of rabbits. kg,±s, n=8

表5　兔體質(zhì)量變化結(jié)果. kg,±s, n=8Tab 5 Change of body weight of rabbits. kg,±s, n=8

組別　第1天　第23天空白基質(zhì)組　0.790±0.082　1.230±0.122低劑量組　0.860±0.102　1.270±0.170中劑量組　0.830±0.140　1.190±0.329高劑量組　0.860±0.108　1.440±0.175

表6　兔子宮指數(shù)、子宮分級和腺體數(shù)±s, n=8Tab 6 Uterus index, uterus grade and the amount of glands of rabbits.±s, n=8

表6　兔子宮指數(shù)、子宮分級和腺體數(shù)±s, n=8Tab 6 Uterus index, uterus grade and the amount of glands of rabbits.±s, n=8

注：與陽性對照組比較，*P < 0.05Note: compared with positive control group,*P < 0.05

組別　 子宮指數(shù)/%　子宮分級　腺體數(shù)空白基質(zhì)組 0.012±0.003*　 0.30±0.46*5.00±2.10*陽性對照組 0.064±0.039　 3.20±0.27　 25.00±5.45低劑量組　 0.019±0.014*　 1.00±0.61*10.00±5.35*中劑量組　 0.020±0.023　 1.80±0.50　 10.00±3.61*高劑量組　 0.030±0.022　 2.30±0.50　 9.00±6.23*

由表5可知，經(jīng)過23 d給藥，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組兔體質(zhì)量均有增加。采用q檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，與空白基質(zhì)組進(jìn)行比較，低、中、高劑量組均無顯著性差異。

由表6可知，隨著黃體酮凝膠劑量的增加，兔子宮指數(shù)、子宮分級指數(shù)均呈增加趨勢，子宮腺體數(shù)目低、中、高劑量組較空白組增加。采用q檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，子宮指數(shù)和子宮分級比較結(jié)果顯示：空白基質(zhì)組、低劑量組與陽性對照組之間有顯著性差異，中劑量組、高劑量組與陽性對照組之間無顯著性差異。這說明給予黃體酮凝膠劑后，隨著給藥劑量的增加，子宮內(nèi)膜厚度增加，兔的孕酮反應(yīng)增強；對腺體數(shù)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，空白基質(zhì)組、低、中、高劑量組與陽性對照組之間有顯著性差異，但其余各組之間無顯著性差異，這說明黃體酮凝膠劑與陽性對照組相比，對子宮腺體數(shù)目的影響不明顯。結(jié)合子宮指數(shù)和子宮分級結(jié)果進(jìn)行分析，與陽性對照組相比，黃體酮凝膠劑中、高劑量組對兔子宮內(nèi)膜的增生、子宮腺體的增多、子宮由增生期轉(zhuǎn)化為分泌期具有一定的作用。

4　討論

4.1凝膠劑的處方

本制劑以水溶性凝膠為基質(zhì)，由于黃體酮為弱極性物質(zhì)，不溶于基質(zhì)，故用無水乙醇與吐溫-80提高黃體酮的溶解度，從而得到均勻細(xì)膩、無沙粒感的半透明凝膠。

4.2凝膠劑的評價

在凝膠劑的制備過程中發(fā)現(xiàn)，選用凝膠劑的鋪展性、細(xì)膩度及離心、冷凍、高熱后是否分層等指標(biāo)無法評價和區(qū)分凝膠劑的質(zhì)量是否合格，且評價指標(biāo)主觀性較強，因此在本實驗中采用黏度、觸變性、屈服值等流變學(xué)指標(biāo)，能夠較全面的評判凝膠劑的質(zhì)量[12-13]。

4.3孕激素的藥效考察

孕激素的藥效實驗方法有多種[10]，其中采用子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實驗較簡便可行，該法通過給予未成年幼兔一定量孕激素后，根據(jù)給藥后兔子宮內(nèi)膜變化進(jìn)行分級，以判定孕激素的作用。本文在參照孕激素兔子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實驗的基礎(chǔ)上，同時計算子宮指數(shù)和腺體數(shù)，以綜合指標(biāo)考察黃體酮凝膠劑給藥后的藥效，比單用子宮內(nèi)膜分級指標(biāo)評價黃體酮藥效更為合理和準(zhǔn)確。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予黃體酮凝膠劑后，凝膠劑中的黃體酮能使雌性未成熟兔子宮內(nèi)膜腺體明顯發(fā)育，且其變化與孕激素劑量呈正比關(guān)系。與陽性對照組相比，各組兔子宮指數(shù)和分級指數(shù)中、高劑量組可達(dá)到陽性對照組水平，說明凝膠劑中、高劑量組藥效與陽性對照組類似，但子宮腺體的數(shù)目增加不如陽性對照組明顯，這一方面可能是因為在計算腺體時系人為目測存在誤差，另一方面也可能因凝膠劑盡管有一定的作用，但作用弱于黃體酮注射劑，其藥效結(jié)果還有待于深入研究。

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收稿日期：（2014-11-18 修回日期：2015-03-17）

[作者簡介]王梅，女，副教授，研究方向：藥物新劑型及靶向給藥制劑。E-mail：wm630@163.com

[基金項目]新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱澷Y助項目（XJEDU2011S25）

[中圖分類號]R94

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672 – 8157(2015)04 – 0205 – 04