武陽(yáng),晏彪，焦銘，廖文莉，陳姣娥，楊旭，馬 萍,*

1. 湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，咸寧 437100 2. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

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鄰苯二甲酸二異壬酯致小鼠腎組織氧化損傷的研究

武陽(yáng)1,2,晏彪2，焦銘1，廖文莉1，陳姣娥1，楊旭2，馬 萍1,2,*

1. 湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，咸寧 437100 2. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079

鄰苯二甲酸二異壬酯是一種新型替代增塑劑，對(duì)其毒性研究已受到廣泛關(guān)注。為探究鄰苯二甲酸二異壬酯對(duì)腎組織的氧化損傷作用，將昆明小鼠隨機(jī)分為5組，包括1個(gè)陰性對(duì)照組、4個(gè)鄰苯二甲酸二異壬酯染毒組，按0.5、5、50和500 mg·kg-1四個(gè)劑量水平灌胃染毒14天。制備小鼠腎組織切片進(jìn)行病理學(xué)觀察，以腎組織勻漿測(cè)定活性氧(reactive oxygen species, ROS)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG)的含量，以腎組織細(xì)胞懸液測(cè)定DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DNA-protein Crosslink, DPC)系數(shù)。隨著鄰苯二甲酸二異壬酯染毒劑量的升高，小鼠腎組織的損傷程度加重，ROS、MDA、8-OHdG含量和DPC系數(shù)逐漸上升，GSH含量逐漸降低，各指標(biāo)均呈一定劑量-效應(yīng)關(guān)系。染毒劑量為5 mg·kg-1時(shí)，ROS、DPC系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；染毒劑量為50 mg·kg-1和500 mg·kg-1時(shí)，ROS、GSH、8-OHdG、MDA含量和DPC系數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明較高劑量(≥50 mg·kg-1)鄰苯二甲酸二異壬酯可造成小鼠腎組織氧化損傷。

鄰苯二甲酸二異壬酯；昆明小鼠；氧化損傷；活性氧；還原型谷胱甘肽；丙二醛；8-羥基脫氧鳥苷；DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)

鄰苯二甲酸酯(phthalates, PAEs)又稱酞酸酯，廣泛應(yīng)用于各種塑料制品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中，最主要用途是作為增塑劑用以增強(qiáng)塑料的可塑性和柔韌性。傳統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的PAEs是鄰苯二甲酸二乙基己基酯(di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(Benzyl butyl phthalate, BBP)和鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)。PAEs為脂溶性物質(zhì)，與塑料基質(zhì)之間以非共價(jià)鍵結(jié)合，易通過淋洗、遷移等方式從塑料制品中釋出進(jìn)入環(huán)境中，同時(shí)具揮發(fā)性低，吸附性強(qiáng)等特點(diǎn)，可積累存在于水體、土壤、空氣等多種環(huán)境介質(zhì)中[1]。

研究表明傳統(tǒng)增塑劑(DEHP、BBP、DBP)屬于“環(huán)境內(nèi)分泌干擾物”：其進(jìn)入體內(nèi)后可與性激素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，干擾血液中性激素正常水平的維持，表現(xiàn)為生殖發(fā)育功能紊亂(如男童睪丸發(fā)育不全、隱睪、陰莖短小，女童乳房發(fā)育早熟等)[2-3]。為了規(guī)避傳統(tǒng)增塑劑所致的生殖發(fā)育毒性，歐盟和美國(guó)已經(jīng)嚴(yán)格限制這三種增塑劑在玩具和兒童護(hù)理用品中的含量，同時(shí)一批替代型高分子量增塑劑開始得到各國(guó)的廣泛應(yīng)用[4]，鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)就是其中的一種[5]。

DINP可通過口服、皮膚接觸和吸入等途徑進(jìn)入人體，其中經(jīng)飲食進(jìn)入是最主要的暴露途徑[6]。目前無(wú)直接證據(jù)證明DINP可引起人類和嚙齒類動(dòng)物生殖系統(tǒng)畸變，而關(guān)于其非生殖發(fā)育毒性的研究也較少，如Kaufmann等發(fā)現(xiàn)DINP在大鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)過氧化物酶的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)肝部腫瘤的發(fā)生[7]；Koike等發(fā)現(xiàn)DINP可加重NC/Nga小鼠過敏性皮炎模型的相關(guān)癥狀[8]。近年來，氧化應(yīng)激途徑已成為毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，過量自由基可以攻擊生物大分子，產(chǎn)生損傷，引發(fā)腫瘤、畸形、衰老等多種后果。已有充分報(bào)道證明DEHP和DBP等傳統(tǒng)增塑劑可誘發(fā)小鼠臟器的氧化損傷[9-11]，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于DINP對(duì)小鼠氧化損傷的研究還較少[12]，同時(shí)腎臟是化學(xué)毒物重要的靶器官，在毒理學(xué)研究中具重要意義。因而我們采用灌胃(口服)染毒法，記錄小鼠體重和腎臟重量，觀察腎組織切片形態(tài)變化，檢測(cè)小鼠腎組織勻漿活性氧(reactive oxygen species, ROS)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)及8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG)含量變化，并測(cè)定腎細(xì)胞懸液DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)(DNA-protein crosslinks , DPC)的變化，以探討DINP對(duì)小鼠腎臟毒性的可能機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：Power wave XS酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，F(xiàn)Lx 800熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)，F(xiàn)-4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，DP73光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，5415R低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，RM2245切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，HH-42三用電熱恒溫水箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

主要試劑：鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP，≥99.6%，Sigma公司)，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA，>99.9%，Sigma公司)，蛋白酶K(Sigma公司)，小鼠8-羥基脫氧鳥苷ELISA檢測(cè)試劑盒(濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司)，還原型谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Hoechst33258熒光染料(Sigma公司)，三羥基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，分析純，Amresco分裝)，5,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硫代巴比妥酸(TBA，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS, 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他使用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的SPF級(jí)雄性昆明小鼠30只(合格證號(hào)：No. 4200060000 1226)，體重為(33.15 ± 1.15) g，適應(yīng)性馴養(yǎng)一周后實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2013-0071。飼養(yǎng)過程中，每日定時(shí)定量給予商業(yè)用鼠糧，并及時(shí)補(bǔ)充飲用水。小鼠養(yǎng)于無(wú)菌無(wú)病原專用鼠籠內(nèi)，可自由取食飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20～25℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為50%～70%，保持室內(nèi)安靜，避免強(qiáng)光照對(duì)小鼠影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和染毒

國(guó)際所規(guī)范的DINP可接受的日攝入量(acceptable daily intake，ADI)上限在0.02～0.14 mg·kg-1之間。在ADI水平的基礎(chǔ)上，Lington等[13]實(shí)驗(yàn)表明，DINP的無(wú)毒性反應(yīng)劑量(No Observed Adverse Effect Level，NOAEL)為15 mg·kg-1，而Moore[14]的研究表明DINP的NOAEL可達(dá)88 mg·kg-1。因此考慮到DINP劑量的不確定性，模擬評(píng)估DINP最大的風(fēng)險(xiǎn)劑量，參照Gray等[15]和McKee等[16]的研究，將500 mg·kg-1作為本實(shí)驗(yàn)的最高染毒劑量，并以0.05mg·kg-1作為本實(shí)驗(yàn)的最低染毒劑量。

將30只昆明小鼠隨機(jī)分為5組，包括1個(gè)陰性對(duì)照組、4個(gè)DINP染毒組，每組6只。染毒組的染毒劑量分別為0.5、5、50、500 mg·kg-1，以生理鹽水將母液稀釋成0.05、0.5、5和50 mg·mL-14種濃度的染毒液，在稀釋過程中加與DINP等量的吐溫80助溶；因吐溫80僅為DINP的助溶劑，量很小，對(duì)生物體無(wú)毒無(wú)副作用，所以陰性對(duì)照組只是給予生理鹽水。染毒液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前在旋渦混懸儀上充分混勻。均經(jīng)口灌胃給予，灌胃量為10 mL·kg-1，每天固定時(shí)間染毒1次，連續(xù)染毒14 d，分別于每次染毒前稱小鼠重量并記錄。

1.2.2 腎組織稱重及臟器系數(shù)

染毒結(jié)束后用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取腎組織，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗，濾紙拭干，電子天平稱重腎組織并記錄數(shù)值。根據(jù)如下公式計(jì)算小鼠臟器的相對(duì)系數(shù)比：臟器系數(shù)(%)=臟器濕重/小鼠體重×100 %。

1.2.3 腎組織切片的制備和觀察

腎組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟切片，H&E染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的病理組織學(xué)變化。

1.2.4 腎組織勻漿和懸液的制備

腎組織于冰冷PBS(pH=7.5)中漂洗，濾紙拭干，分成兩部分，一部分腎組織加冰冷PBS重懸制成10% (10 mg·L-1)勻漿液，4 ℃，9 300 × g 離心10 min后取上清，用于ROS、GSH、MDA和8-OHdG檢測(cè)。另一部分腎組織在冰冷PBS中剪成≈1mm3糜狀組織塊，4層擦鏡紙過濾，濾液200×g離心5 min后離心取上清，再加冰冷PBS重懸細(xì)胞，用于DPC檢測(cè)。

1.2.5 ROS含量的測(cè)定

取腎組織勻漿上清液4 μL，加入396 μL PBS作100倍稀釋。取100 μL稀釋液上樣于酶標(biāo)板中，加入100 μL熒光染料DCFA-DA，37℃黑暗環(huán)境中孵育5min，使用熒光酶標(biāo)儀在485 nm激發(fā)光、520 nm發(fā)射光條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度值，熒光強(qiáng)度值以相對(duì)熒光強(qiáng)度單位(relative fluorescence units, RFU)表示。

1.2.6 GSH含量和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

GSH含量的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。GSH含量(μmol·gprot-1)=[(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本稀釋倍數(shù)/待測(cè)勻漿蛋白濃度(gprot·L-1)。蛋白質(zhì)含量按照Folin-酚法測(cè)定。

1.2.7 MDA含量的測(cè)定

取500 μL腎組織勻漿上清液于試管中，加入2 mL 0.6%TBA，沸水浴15 min。取上清1 mL于EP管中，10 000 ×g離心5 min。取上清100 μL上樣于酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀分別在450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(以PBS為對(duì)照)，按照公式計(jì)算MDA濃度(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56A450(A為吸光度)，再根據(jù)樣品中蛋白含量計(jì)算MDA含量：樣品中MDA含量(μmol·gprot-1)=MDA濃度/樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 8-OHdG含量的測(cè)定

8-OHdG含量的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。以0、3、6、12、24、48 ng·mL-1等標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，450 nm 處OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中8-OHdG濃度。再根據(jù)樣品中蛋白含量計(jì)算8-OHdG含量：樣品中8-OHdG含量(ng·mgprot-1)=8-OHdG濃度/樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.9 DPC系數(shù)的測(cè)定

DPC采用KCl-SDS沉淀法進(jìn)行檢測(cè)[17]。首先向樣品中加入SDS，使之與 DPC 及蛋白質(zhì)結(jié)合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白質(zhì)沉淀，而游離的DNA留在上清液中。將上清液轉(zhuǎn)移后，再向沉淀中加入蛋白酶 K 除去蛋白質(zhì)，使 DPC 中的 DNA 游離出來，用熒光法測(cè)定此 DNA 的含量 A (交聯(lián) DNA)以及原液中 DNA 的含量 B(游離 DNA)，計(jì)算 DPC系數(shù) η[η=A/(A+B) ]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果 (Results)

2.1 小鼠體重和臟器系數(shù)

不同DINP劑量組小鼠體重和腎的臟器系數(shù)如表1所示。與對(duì)照組比較，0.5、5、50、500 mg·kg-1DINP劑量組小鼠體重和腎臟器系數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。

Table 1 Mouse body weight of different

DINP劑量/(mg·kg-1)DINPdose/(mg·kg-1)染毒前體重/gBodyweightbeforeexposure/g染毒后體重/gBodyweightafterexposure/g腎臟系數(shù)/%Liverindex/%033．29±1．6135．15±2．260．0118±0．110．534．55±2．0136．26±2．120．0117±0．10533．93±1．7335．69±1．600．0121±0．115034．83±2．0636．56±3．070．0127±0．0350034．35±2．7135．52±2．900．0121±0．09

2.2 小鼠腎組織形態(tài)的光鏡觀察結(jié)果

小鼠腎組織切片見圖1，由圖中可見，對(duì)照組和0.5 mg·kg-1DINP劑量組小鼠腎小體及腎小管形態(tài)正常；5 mg·kg-1DINP劑量組腎小體形態(tài)正常，血管球緊致成團(tuán)，腎小管上皮細(xì)胞水腫明顯，管腔狹窄；50 mg·kg-1DINP劑量組腎小體萎縮，腎小管受壓明顯，上皮細(xì)胞變性壞死；500 mg·kg-1DINP劑量組腎小體血管球增生肥大，與囊壁界限不清，腎小管相互擠壓嚴(yán)重，上皮細(xì)胞壞死。

2.3 小鼠腎組織ROS含量的變化

不同劑量組腎組織的ROS含量的變化見圖2，隨著染毒劑量的升高，ROS含量逐漸上升，并呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組比較，0.5 mg·kg-1劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5、50、500 mg·kg-1劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 不同處理組腎組織切片圖(10×40，H&E染色，n=6)Fig. 1 Kidney slices of different groups (10×40, H&E stains, n=6)

圖2 不同處理組小鼠腎臟ROS含量(n=6，F(xiàn)=4.8016，P <0.01；經(jīng)LSD檢驗(yàn)，**：與對(duì)照組相比較，P <0.01)Fig. 2 ROS content in mouse kidney of different groups(n=6，F(xiàn)=4.8016，P <0.01；by LSD test，**：P <0.01，compare with control group)

2.4 小鼠腎組織GSH含量的變化

不同劑量組腎組織的GSH含量的變化見圖3，隨著DINP染毒劑量的升高，GSH含量逐漸下降，呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組比較，0.5、5 mg·kg-1劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，50、500 mg·kg-1劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 不同處理組小鼠腎GSH含量(n=6, F=3.1103, P <0.05；經(jīng)LSD檢驗(yàn), *：與對(duì)照組相比較, P <0.05)Fig. 3 GSH content in mouse kidney of different groups(n=6，F(xiàn)=3.1103，P <0.05；by LSD test，*：P <0.05，compare with control group)

2.5 小鼠腎組織MDA含量的變化

不同劑量組腎組織的MDA含量的變化見圖4，不同劑量的DINP均能使小鼠腎組織MDA含量有不同程度的升高。與對(duì)照組比較，0.5、5 mg·kg-1劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，50、500 mg·kg-1劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P <0.01)。

圖4 不同處理組小鼠腎MDA含量(n=6，F(xiàn)=3.8661，P <0.05；經(jīng)LSD檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比較，*：P <0.05，**：P <0.01)Fig. 4 MDA content in mouse kidney of different groups(n=6，F(xiàn)=3.8661，P <0.05；by LSD test，*：P <0.05，**：P <0.01，compare with control group)

2.6 小鼠腎組織8-OHdG含量的變化

不同劑量組腎組織的8-OHdG含量的變化見圖5，不同劑量的DINP能使小鼠腎組織8-OHdG含量有不同程度的升高。與對(duì)照組比較，0.5、5 mg·kg-1劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，50、500 mg·kg-1劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P <0.01)。

圖5 不同處理組小鼠腎8-OHdG含量(n=6，F(xiàn)=3.4592，P <0.05；經(jīng)LSD檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比較，*：P <0.05，**：P<0.01)Fig. 5 8-OHdG content in mouse kidney of different groups (n=6，F(xiàn)=3.4592，P <0.05；by LSD test，*：P <0.05，**：P <0.01，compare with control group)

2.7 小鼠腎細(xì)胞DPC系數(shù)的變化

不同劑量組腎細(xì)胞DPC系數(shù)的變化見圖6。隨著DINP染毒劑量的升高，DPC系數(shù)逐漸上升，呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組比較，0.5 mg·kg-1劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，5、50、500 mg·kg-1劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

圖6 不同處理組小鼠腎DPC系數(shù)含量 (n=6，F(xiàn)=5.2705，P <0.01；經(jīng)LSD檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比較，*：P <0.05，**：P<0.01)Fig. 6 DPC coefficient in mouse kidney of different groups(n=6，F(xiàn)=5.2705，P <0.01；by LSD test，*：P <0.05，**：P <0.01，compare with control group)

3 討論(Discussion)

3.1 DINP對(duì)小鼠體重和腎臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)適用于肝、腎、腦、肺、睪丸等主要臟器。如果臟器系數(shù)增大，表示臟器可能出現(xiàn)充血、水腫和增生肥大等病變；如果臟器系數(shù)減小，表示臟器可能出現(xiàn)萎縮和退行性改變。本研究DINP處理并未引起小鼠體重和腎臟器系數(shù)發(fā)生顯著變化，說明DINP在本實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

3.2 DINP對(duì)小鼠腎組織形態(tài)的影響

腎臟的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要條件，它在代謝產(chǎn)物排出、水平衡調(diào)節(jié)、電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)、酸堿平衡調(diào)節(jié)、血壓調(diào)控和激素(如腎素、紅細(xì)胞生成素等)的合成與釋放等生理過程中都起著很重要的作用。腎臟的生理特征決定了其對(duì)毒物的易感性，其具多種解毒功能和較強(qiáng)的代償功能，因而腎臟是毒物重要的靶器官，在毒理學(xué)研究中具重要意義[18]。

腎組織切片觀察顯示：隨著DINP染毒劑量的升高，腎小管上皮細(xì)胞水腫程度逐漸加重，管腔逐漸變窄且相互擠壓程度加重，腎小球逐漸肥大并且增生。說明DINP可引起腎組織病理性損傷，并具一定劑量-效應(yīng)關(guān)系。DINP暴露小鼠在5 mg·kg-1劑量組表現(xiàn)為腎小管管腔狹窄和上皮細(xì)胞明顯水腫，在50 mg·kg-1劑量組進(jìn)而表現(xiàn)為上皮細(xì)胞顯著壞死癥狀，這是由于化學(xué)毒物易滲入到近曲小管細(xì)胞內(nèi)，并在腎近曲小管內(nèi)選擇性蓄積和濃縮，引起管腔狹窄，進(jìn)而導(dǎo)致阻塞[18]。相對(duì)腎小管而言，腎小球?qū)τ诙疚锬褪苄暂^強(qiáng)[18]，在500 mg·kg-1劑量組則表現(xiàn)出明顯腎小球增生肥大癥狀，表明此濃度組DINP對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷已非常顯著。

3.3 DINP對(duì)小鼠腎組織氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響

腎功能的維持需要大量的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而腎臟的代謝活動(dòng)非常活躍，并在氧代謝活動(dòng)中大量產(chǎn)生自由基，細(xì)胞中 ROS 含量是反映細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的主要指標(biāo)。作為人體正常代謝產(chǎn)物，ROS對(duì)維持機(jī)體正常生命活動(dòng)起促進(jìn)作用，包括參與機(jī)體防御、作為信號(hào)分子調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[19]。正常機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，腎臟借助自身含量豐富的抗氧化劑可以及時(shí)有效地清除ROS。還原型GSH是ROS的主要清除劑，其可以和ROS結(jié)合形成硫代半縮醛,并生成具更強(qiáng)抗氧化作用的抗壞血酸。GSH的消耗可以反映機(jī)體的氧化損傷程度，在評(píng)價(jià)氧化損傷中具重要意義[20-21]。毒性物質(zhì)產(chǎn)生的異常濃度ROS會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和抗氧化防御之間的平衡，從而引起各種生物大分子物質(zhì)(脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等)的氧化損傷，改變細(xì)胞的功能和效應(yīng)，最終導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[22]。過量的ROS可直接或間接進(jìn)攻脂質(zhì)分子引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，脂質(zhì)過氧化可以使細(xì)胞膜流動(dòng)性改變和脆性增加，使膜成分之間發(fā)生交聯(lián)，增加細(xì)胞膜及膜性細(xì)胞器通透性，導(dǎo)致離子轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝等細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能紊亂。醛類終產(chǎn)物MDA生成量高低可作為衡量脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度的指標(biāo)[23]。

本研究中5 mg·kg-1劑量組小鼠腎組織ROS水平顯著上升，但GSH含量并無(wú)顯著變化，而50mg·kg-1DINP處理組GSH 含量顯著下降，MDA含量顯著上升。說明5 mg·kg-1DINP已可使機(jī)體產(chǎn)生過量自由基，但并未破壞氧化還原平衡狀態(tài)，而50 mg·kg-1處理可導(dǎo)致GSH大量損耗 ，使機(jī)體氧化/抗氧化之間平衡狀態(tài)受到破壞，誘導(dǎo)小鼠腎細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，這與50 mg·kg-1組處理可造成小鼠腎臟組織病理學(xué)改變現(xiàn)象是相互驗(yàn)證的。本結(jié)果與同系物BBP染毒濃度升高可導(dǎo)致小鼠腎組織氧化損傷的結(jié)論是相一致的[24]。

3.4 DINP對(duì)小鼠腎臟DNA的氧化損傷

DNA是ROS攻擊的重要靶分子之一，損傷表現(xiàn)為DNA分子堿基修飾和鏈斷裂兩大類，DNA損傷可能是突變或癌變的基礎(chǔ)。8-OHdG是最具代表性的堿基修飾產(chǎn)物，在復(fù)制時(shí)可以導(dǎo)致G:C→T:A的堿基顛換，這種顛換可能激活原癌基因或抑制抑癌基因的活力，在癌變和畸變過程中可能起重要作用。8-OHdG只能通過DNA 氧化損傷途徑形成，是公認(rèn)的一種新型評(píng)價(jià)DNA氧化損傷狀態(tài)的生物標(biāo)志物[25]。DNA還可以與組蛋白的賴氨酸殘基結(jié)合形成DPC，DPC只可能在轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的過程中形成，它的存在阻滯了DNA 的正常轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，可能導(dǎo)致染色體斷裂、缺失、基因丟失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤或某些嚴(yán)重疾病的發(fā)生，因而DPC可以作為機(jī)體潛在突變的分子標(biāo)志物[26]。本研究中，500 mg·kg-1DINP劑量組8-OHdG含量和 DPC系數(shù)均顯著上升，說明高濃度DINP可以引起小鼠腎組織 DNA 堿基點(diǎn)突變和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物形成，造成腎組織DNA損傷，并可能導(dǎo)致小鼠腎組織的進(jìn)一步病變甚至癌變。

綜上所述，50 mg·kg-1和500 mg·kg-1劑量組DINP可導(dǎo)致小鼠腎組織ROS過量產(chǎn)生，破壞氧化與抗氧化平衡，引起腎組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和8-OHdG的形成，以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)的增加，導(dǎo)致腎組織發(fā)生病理性損傷。

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◆

Study on the Oxidative Damage of Mouse Kidney Tissue Induced by Diisononyl Phthalate

Wu Yang1, 2, Yan Biao2, Jiao Ming1, Liao Wenli1, Chen Jiaoe1, Yang Xu2, Ma Ping1, 2,*

1. Lab of Environmental Biomedicine, College of Basic Medical Sciences, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China 2. Lab of Environmental Biomedicine, College of Life Science, Huazhong Normal University, WuHan 430079, China

Received 5 January 2015 accepted 7 April 2015

Diisononyl phthalate (DINP) has been widely used in polyvinyl chloride (PVC) products and is ubiquitous as a substitute; however, its toxicity due to exposure remains to be determined. This study investigated the oxidative damage induced by diisononyl phthalate on mouse kidney tissue. Kunming mice were randomly grouped into five groups and orally administered with drugs daily for fourteen days; the groups included one solvent control group, four diisononyl phthalate groups, the exposure doses of disononyl phthalate groups were 0.5, 5, 50 and 500 mg·kg-1respectively. Kidney tissue sections were isolated and stained for pathological observations under microscope. Contents of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) in kidney tissue homogenates，and DNA-protein crosslink (DPC) coefficients in the kidney cell suspensions were measured. Results showed that kidney tissue injury was severed gradually with the increase of diisononyl phthalate exposure concentration, contents of ROS, MDA, 8-OHdG and DPC coefficients increased gradually in a dose-dependent manner, whereas GSH content decreased accordingly. In the 5 mg·kg-1exposure group, ROS contents and DPC coefficients were higher compare with the control group (P<0.05, P<0.01). In the high-dose exposure groups (50 and 500 mg·kg-1), there were significant differences in levels of each biomarker compare with the control group (P<0.05，P<0.01). Data suggest that diisononyl phthalate at certain doses (≥50 mg·kg-1) can induce damage in mice kidney，and oxidative damage is involved in diisononyl phthalate-induced kidney toxicity.

diisononyl phthalate; Kunming mice; oxidative damage; reactive oxygen species; glutathione; malondialdehyde; 8-hydroxy-2-deoxyguanosine; DNA-protein crosslinks

湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB284)，湖北科技學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BK1412)，國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(51136002)

武陽(yáng)(1983- )，男，博士，講師，研究方向?yàn)榧?xì)胞分子毒理學(xué)及環(huán)境醫(yī)學(xué)，Email: wysj2007@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mping68@126.com

10.7524/AJE.1673-5897-20150105002

2015-01-05 錄用日期：2015-04-07

1673-5897(2015)3-268-08

X171.5

A

馬萍(1968-)，女，碩士，教授。主要從事環(huán)境醫(yī)學(xué)、細(xì)胞分子毒理學(xué)方面研究，已發(fā)表學(xué)術(shù)論文近30篇。

武陽(yáng), 晏彪, 焦銘, 等. 鄰苯二甲酸二異壬酯致小鼠腎組織氧化損傷的研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(3): 268-275

Wu Yang, Yan Biao, Jiao M, et al. Study on the oxidative damage of mouse kidney tissue induced by diisononyl phthalate [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 268-275 (in Chinese)