王建，竇巧惠，于世欣，王逸筠，崔秀敏

土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，泰安 271018

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外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗L-精氨酸代謝的影響

王建，竇巧惠，于世欣，王逸筠，崔秀敏*

土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，泰安 271018

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為生物活性分子，廣泛參與各種生物和非生物脅迫。采用營養(yǎng)液培養(yǎng)，研究Cu脅迫下番茄體內(nèi)L-精氨酸、NO、多胺代謝對外源NO的響應(yīng)機(jī)制，以期為銅污染區(qū)域蔬菜種植提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。結(jié)果表明，Cu脅迫下添加外源SNP(硝普鈉，外源NO供體)能夠調(diào)節(jié)番茄根系和葉片中精氨酸脫羧酶(Arginine Decarboxylase ，ADC)、鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase，ODC)及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)活性。根系中，外源SNP能夠上調(diào)NOS活性， L-精氨酸代謝向著NO合成方向進(jìn)行；葉片中，外源SNP能夠同時上調(diào)ADC、ODC、NOS活性，PA、NO的合成同時進(jìn)行；此外，Cu脅迫下添加外源SNP能夠增加根系和葉片L-精氨酸含量，而作為PA、NO的合成前體，精氨酸含量升高無疑會間接促進(jìn)PA、NO的合成，從而提高番茄對Cu脅迫的抵抗能力。

Cu脅迫；番茄；一氧化氮；L-精氨酸；多胺

在過去的50年中，大約有939 000 t的Cu排放到全球環(huán)境中，其中大部分進(jìn)入土壤，引起了土壤重金屬污染[1]。重金屬污染不僅引起土壤組成、結(jié)構(gòu)和功能的變化，還能夠抑制作物根系生長和光合作用，導(dǎo)致一系列生物代謝過程紊亂，致使作物減產(chǎn)甚至絕收[2]。更為重要的是，重金屬還可通過食物鏈遷移到動物、人體內(nèi)，危害人體、動物健康[3-4]。

NO是一個不穩(wěn)定的自由基，作為細(xì)胞間信使在植物體內(nèi)各種生理過程中起著關(guān)鍵作用，如根系伸展[5]、防御體系相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞程序性死亡[6]。除此之外，NO還參與植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，如鹽害[7]、干旱[8]、重金屬脅迫[9-11]等。植物體內(nèi)NO的來源主要有酶促[NOS、硝酸還原酶(Nitrate Reductase，NR)]和非酶促途徑。在酸性環(huán)境中，亞硝酸還原也會形成NO[12]。

L-精氨酸是植物體內(nèi)碳氮比較高的氨基酸之一，植物體內(nèi)L-精氨酸通過ADC、ODC合成酶合成多胺[13-14]，多胺(腐胺、精胺、亞精胺)是生物體內(nèi)的具有生理活性的一類低分子量的直鏈脂肪族含氮堿，它們參與細(xì)胞分裂、DNA的凝聚、膜的穩(wěn)定、激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及動植物的抗逆性等多種生理生化過程和反應(yīng)[15]。除了用于合成多胺外，植物體內(nèi)的L-精氨酸還可以通過NOS合成酶合成NO[16]，用于緩解植物對生物和非生物脅迫的傷害。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試番茄(Solanum lycopersicum L.)為“改良毛粉802F1”。NO供體硝普鈉([Na2Fe(CN)5]NO，SNP，購自Sigma公司)和Cu2+供體CuCl2的適宜濃度由預(yù)備試驗(yàn)確定，先用蒸餾水配成200 μmol·L-1的母液，4 ℃避光保存，用時按所需濃度稀釋。牛血紅蛋白(Hb，購自Sigma公司)為NO的清除劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室內(nèi)進(jìn)行，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗。種子經(jīng)55 ℃溫湯浸種消毒15 min，然后在潤濕的吸水紙上26 ℃催芽。待種子露白后，播于洗凈的蛭石中，萌發(fā)后用1/4 Hoagland營養(yǎng)液澆灌。當(dāng)幼苗具有3～4片真葉片時，挑選生長一致的植株洗凈根部蛭石后，移栽于4 L塑料桶中，用厚度為3 cm的泡沫塑料板做成長方形蓋子，覆蓋在塑料桶頂部。每盆栽4株，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行栽培。1周后換成完全營養(yǎng)液，此后每3 d更換一次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液栽培期間用電動氣泵24 h連續(xù)通氣。

番茄植株長至5～6片真葉片時進(jìn)行Cu脅迫處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)5個處理：(1)對照，Hoagland完全營養(yǎng)液；(2)50 μmol·L-1CuCl2;(3)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP；(4)50 μmol·L-1CuCl2+100 μmol·L-1SNP+0.1% Hb；(5)50 μmol·L-1CuCl2+0.1% Hb，分別用CK、Cu、Cu+S、Cu+S+H、Cu+H表示。每個處理三次重復(fù)，溫室內(nèi)隨機(jī)排列。用低濃度的KOH或者HCl調(diào)節(jié)pH至5.5±0.2，溫室內(nèi)光照(光照強(qiáng)度為320 μmol·m-2·s-1)約12 h，白天最高溫度32 ℃，夜間最低溫度15 ℃。于處理后的1, 3, 6, 24, 48, 72 h分別收獲植株根系及葉片。部分新鮮樣品用于測定酶活性，其它樣品液氮速凍，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 L-精氨酸含量測定

稱樣品30～50 mg于水解管中，加6 mol·L-1鹽酸6 mL，在酒精噴燈上封口，然后置于110 ℃烘箱中水解10 h。將已水解的溶液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，再用水沖洗水解管定容，搖勻過濾。濾液用于L-鳥氨酸、精氨酸測定。吸濾液1～2 mL注入刻度試管中，加10%氫氧化鈉1～2 mL，用少量水沖洗管壁，搖勻后再加0.15%甲萘酚0.3 mL和次氯酸鈉1 mL，然后再加水至9 mL，搖勻，立即置于(連同試管架) 冰水浴中(冰塊加一定量水)。顯色20 min，取出加40%尿素1 mL搖勻，室溫下放5～10 min在721 型分光光度計上530 nm 波長下比色，讀其光密度，求精氨酸含量。

精氨酸含量=斜率×樣品稀釋倍數(shù)×光密度×10-6

1.3.2 ADC、ODC活性測定

①參照趙福庚等[17]具體方法如下：

取1.0 g 幼苗葉片和根系，加入3 mL 預(yù)冷的提取液[50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液，pH為6.3，內(nèi)含5 mmol·L-1EDTA、0.1 μmol·L-1PMsF(苯甲基磺酰氟)、40 μmol·L-1磷酸吡哆醛、不溶性PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、5 mmol·L-1DTT(二硫蘇糖醇)、20 mmol·L-1Vc)]，研磨后4 ℃下12 000×g 離心15 min，取上清液加硫酸銨達(dá)飽和度60%，離心后沉淀溶于10 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 6.3) ， 4 ℃透析過夜，再加入2 倍體積的預(yù)冷丙酮，沉淀溶于磷酸緩沖液中( pH 6.3)， 4 ℃透析過夜后15 000×g 離心15 min，上清液用于酶活性測定

②ADC、ODC活性測定

反應(yīng)系統(tǒng)體積1.5 mL，包括1 mL100 nmol·L-1Tris-Hcl緩沖液(pH 7.5，內(nèi)含5 mmol·L-1EDTA、40 μmol·L-1磷酸毗哆醛和5 mmol·L-1DTT)、0.3 mL(1.4 mg蛋白·mL-1)ADC提取液，于37 ℃水浴中放置2 min后，加入0.2 mL 25 mmol·L-1q L-Arg、L-Orn(調(diào)pH至7.5)。37 ℃下反應(yīng)60 min后，加入PCA(高氯酸)至終濃度5%(對照在開始即加入PCA)，以3 000 g離心l0 min，取0.5 mL上清液加人l mL 2 mol·L-1NaOH，混合后加入10 μL苯甲酰氯，渦懸振蕩20 s。25 ℃下反應(yīng)60 min后，加入2 mL飽和NaCl，混合后加入2 mL乙醚。振蕩，1 500×g離心5 min，收集l mL醚相，于50 ℃下蒸發(fā)至干，再溶于3 mL重蒸甲醇中，以紫外分光光度計于波長254 nm處測定OD值。酶活以nmol(put)·mg-1(蛋白) ·h-1表示。

1.3.3 多胺含量測定

采用液相色譜法參照劉友良等[18]具體方法如下：

①儀器和試劑

Waters 1500系列，2487雙波長紫外/ 可見檢測器，Breeze色譜工作軟件。腐胺、亞精胺為Fluka產(chǎn)品，精胺為Sigma產(chǎn)品，甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

色譜柱：Novapak C18柱(Waters，150×3.9 mm, 4 μm)。流動相：甲醇：水( 60：40，V/ V )，檢測波長為230 nm，流速0. 7 mL·min-1，柱溫30 ℃。取植物材料1.0～ 2.0 g，加入4mL預(yù)冷的5%高氯酸(V/V)冰盒中研磨、浸提1 h后離心( 15 000×g，30 min，4 ℃)。取500 μL上清液加10 mL帶蓋塑料離心管中，加入7 μL苯甲酰氯，再加入1 mL 2 mol·L-1NaOH，渦漩20 s后在37 ℃水浴反應(yīng)20 min。加入2 mL飽和NaCl溶液，混勻后用2 mL乙醚萃取，1 500×g離心5 min后，取1 mL醚相真空干燥，用100 μL甲醇渦旋溶解后過0. 45 μm的濾膜，取10 μL進(jìn)樣。將 3 種多胺( Put、Spd和Spm) 的標(biāo)準(zhǔn)品配成1 mmol·L-1的貯液，各取40 μL 按上述方法進(jìn)行苯甲?；?。分別取苯甲?；蟮亩喟窐?biāo)準(zhǔn)液0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、0.75、1.0 nmol·(10 μL)-1進(jìn)樣，以面積對進(jìn)樣量作曲線，計算曲線方程和相關(guān)性系數(shù)。

②多胺含量的計算，采用面積外標(biāo)法：

實(shí)際含量=(A樣品/A標(biāo)樣)×(V/樣品質(zhì)量)×C標(biāo)×3

式中：A為峰面積；C標(biāo)為標(biāo)樣濃度；V為定容體積；3為標(biāo)樣稀釋倍數(shù)。

1.3.4 NOS活性測定

取1 g處理后番茄根系和葉片，制備成10%的組織勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，然后參照NOS活性采用試劑盒(南京建成)測定。

1.3.5 內(nèi)源NO含量的測定

內(nèi)源NO含量測定：取0.5 g切成1cm長的葉片鮮樣，在含100 U CAT和100 U SOD的溶液中浸泡5 min用以除去植物內(nèi)源活性氧，然后加入5mL純化好的氧合血紅蛋白溶液(5 mmol·L-1)反應(yīng)2 min，測定反應(yīng)液在577和591 nm吸光值。

內(nèi)源NO釋放量=(OD577-OD591)/11.2

1.3.6 番茄生物量測定

處理8 d后，用去離子水沖洗干凈，吸干多余水分，測定番茄地上部及地下部鮮重(FW)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計軟件對平均數(shù)進(jìn)行方差分析，Duncan法多重比較(P<0.05，不同字母表示差異顯著)，Microsoft Excel軟件繪圖。

2 結(jié)論(Results)

2.1 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系L-精氨酸含量的影響

如圖(1A)所示，單獨(dú)Cu脅迫下番茄葉片處理期間L-精氨酸含量呈降-升-降變化，處理24 h L-精氨酸含量達(dá)到最大值，處理72 h時L-精氨酸含量降至最低。Cu脅迫下添加SNP后L-精氨酸含量呈“∧”趨勢，處理后6 h L-精氨酸含量出現(xiàn)峰值此后開始下降，處理結(jié)束時降至最低。除添加SNP后1 h、24 h外，其余時間段L-精氨酸含量均高于Cu處理。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb，L-精氨酸含量在處理期間呈“升-降-升”趨勢，恰與Cu+S處理趨勢相互補(bǔ)，說明0.1% Hb可以消除SNP釋放的NO對L-精氨酸的促進(jìn)作用；處理期間除處理后1 h、24 h外，其余時間段L-精氨酸含量均低于Cu+S處理。Cu脅迫下單獨(dú)添加外源0.1% Hb，整個處理期間L-精氨酸含量變化呈“N”趨勢，除處理后1 h、24 h、48 h時外其余時間段L-精氨酸含量均高于Cu脅迫。

圖1 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中L-精氨酸含量的影響注：條形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)Fig. 1 Effect of exogenous NO on L-Arginine contents in roots (A) and leaves (B)of tomato under copper stressNote: Different letters above the bars mean significant at the 0.5 level, the same below

Cu脅迫下，根系L-精氨酸含量在處理期間呈下降趨勢圖(1B)，在處理后1-3 h、6-24 h雖有所波動，但增加幅度不顯著，處理結(jié)束時L-精氨酸含量降至最低，整個Cu脅迫期間根系中L-精氨酸含量均低于CK。Cu脅迫下添加外源SNP后1-6 h根系中L-精氨酸含量急劇降低，處理后6 h降至最低；6 h后至處理結(jié)束呈上升趨勢但上升幅度較小，除處理后3 h、6 h外，其余時間段L-精氨酸含量均高于Cu處理。Cu+S處理下添加外源0.1%Hb 3 h后L-精氨酸含量急劇下降，處理6 h時L-精氨酸含量降至最低，處理后6-48 h期間有小幅度回升，但48 h后至處理結(jié)束時又開始下降；除處理后3 h、6 h、72 h外其余時間段L-精氨酸含量均高于Cu+S處理。Cu脅迫下單獨(dú)添加外源0.1% Hb后，根系中L-精氨酸含量呈“升-降-升”變化趨勢，除處理后3 h、6 h時外，其余時間段L-精氨酸含量均高于Cu處理。

2.2 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系A(chǔ)DC活性的影響

如圖(2A)所示，葉片中，處理間ADC活性差異顯著。Cu處理從脅迫開始至處理24 h番茄ADC活性呈下降趨勢且均低于CK，處理后24 h ADC活性降至最低，24 h后至處理結(jié)束ADC活性呈緩慢回升的趨勢；Cu脅迫下添加外源SNP后1 h至3 h ADC活性呈上升趨勢，處理3 h時其活性達(dá)到最大值，ADC活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cu處理；處理后3 h至48 hADC活性呈逐漸下降趨勢，48 h時ADC活性降至最低，除48 h外其余時間段ADC活性均高于Cu處理；添加外源SNP 48 h后至處理結(jié)束ADC活性呈上升趨勢，處理后72 h ADC活性高于對照。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb降低ADC活性，整個處理期間ADC活性呈“N”型變化趨勢，處理后48h時ADC活性降至最低，Cu脅迫處理下添加外源SNP能夠增加ADC活性。Cu脅迫條件下添加外源0.1% Hb，整個處理期間ADC活性變化呈“鋸齒”狀趨勢，處理48 h其活性降至最低。

如圖(2B)所示：根系中，同CK相比，Cu脅迫處理開始至6 h時 ADC活性呈“∧”趨勢，且各時間段ADC活性均低于CK，處理后24 h ADC活性出現(xiàn)峰值，此后至處理結(jié)束ADC活性急劇下降，48 h ADC活性降至最低此后略微回升。整個處理期間CK與Cu脅迫間差異顯著。Cu脅迫條件下添加外源SNP，ADC活性變化趨勢與Cu脅迫下變化趨勢相似，整個處理期間除處理后1 h時ADC活性高于Cu處理外，其余時間段ADC活性均低于對照，處理間除48 h外其它時間段差異均顯著。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb，整個處理期間ADC活性呈“N”型變化趨勢，處理后24 h其活性達(dá)到峰值，處理期間ADC活性均高于Cu+S，處理間差異顯著，同Cu處理和Cu+S+H處理相比，添加外源SNP抑制ADC活性。Cu脅迫條件下添加外源0.1% Hb，ADC活性呈“W”型趨勢，除處理后24 h、72 h外，其余時間段ADC活性均高于Cu處理。

圖2 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)ADC活性的影響Fig. 2 Effect of exogenous NO on ADC activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

2.3 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系ODC活性的影響

如圖(3A)所示：葉片中Cu脅迫處理后番茄ODC活性呈先上升后下降的趨勢，處理后6 h ODC活性達(dá)到最大值，處理結(jié)束時降至最小值；除處理后1 h、24 h外，其余時間段ODC活性均低于對照。Cu脅迫條件下添加外源SNP，ODC活性呈“W”型變化趨勢，處理后6 h ODC活性出現(xiàn)峰值，處理后48 h降至最小值；處理后1 h、6 h、72 h ODC活性高于Cu脅迫，其余時間段低于Cu處理。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb后，ODC活性變化趨勢與Cu+S處理相似，Cu+S+H處理后1 h ODC活性出現(xiàn)峰值；除處理后1 h、48 h外ODC活性均低于Cu+S。Cu脅迫條件下添加外源0.1% Hb，ODC呈“M”型變化趨勢，處理后48h ODC活性出現(xiàn)最大值；除處理后6 h、24 hODC活性低于Cu脅迫外，其余時間段均高于Cu處理。與CK相比Cu脅迫對ODC活性有抑制作用，與Cu處理和Cu+S+H處理相比，添加外源SNP能夠增加ODC活性。

如圖(3B)所示：Cu脅迫處理后根系中ODC活性呈“W”型趨勢，處理后1 h ODC活性出現(xiàn)峰值，48 h后其活性降至最低；處理后1-6 h ODC活性高于對照，6h后至處理結(jié)束ODC活性均低于對照，處理后最初三個時間段Cu脅迫能夠顯著增加根系中ODC活性，但24 h后至處理結(jié)束，Cu脅迫對ODC活性的激活現(xiàn)象消失，ODC活性低于CK。Cu脅迫條件下添加外源SNP，ODC活性呈先下降再上升48 h后趨于穩(wěn)定，除處理后3 h、48 h外，其余時間段ODC活性均低于Cu處理，根系中。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb后1-24 h ODC活性呈先下降后上升趨勢，處理后24 h至處理結(jié)束ODC活性趨于穩(wěn)定。除處理后3 h、6 h時外，其余時間段均高于Cu+S處理，Cu處理和Cu+S+H處理相比，Cu脅迫條件下添加外源SNP抑制根系中ODC活性。Cu脅迫條件下添加0.1% Hb，處理后24 h時ODC活性出現(xiàn)峰值，處理72 h時ODC活性降至最小值，除48 h外其余時間段ODC活性均高于Cu脅迫。

2.4 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系腐胺含量的影響

由圖(4A)可以看出，隨著處理時間的延長，Cu脅迫條件下葉片中腐胺含量呈先升后降的趨勢，處理后48 h腐胺含量出現(xiàn)峰值；除處理后1 h、3 h、6 h外，其余時間段腐胺含量均高于對照。Cu脅迫下添加外源SNP，葉片中腐胺含量變化與Cu脅迫相似，但添加外源SNP后腐胺含量峰值出現(xiàn)在處理后24 h，除處理后1 h、48 h、72 h外，其余時間點(diǎn)腐胺含量均高于Cu脅迫。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb，處理后1～6 h、6 h至處理結(jié)束腐胺含量均呈先上升后下降趨勢，處理后24 h出現(xiàn)峰值，除處理后1 h外其余時間段腐胺含量均低于Cu+S處理。Cu脅迫下單獨(dú)添加外源0.1% Hb后，葉片中腐胺含量變化呈“W”型趨勢，除處理3 h、24 h、48 h外，其余時間段腐胺含量均高于Cu脅迫。如圖所示各處理之間在同一時間點(diǎn)差異均達(dá)到顯著水平。

圖3 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)ODC活性的影響Fig. 3 Effect of exogenous NO on ODC activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

圖4 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中腐胺含量的影響Fig. 4 Effect of exogenous NO on putrescine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

圖(4B)中，Cu處理下，根系中腐胺含量變化呈“M”型趨勢，處理后48 h根系中腐胺含量出現(xiàn)峰值，除處理后24 h外其余時間段腐胺含量均高于對照。Cu脅迫下添加外源SNP，根系中腐胺含量變化呈“N”型趨勢，處理結(jié)束時腐胺含量出現(xiàn)峰值，整個處理期間根系中腐胺含量均高于Cu脅迫。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb，整個處理期間根系中腐胺含量顯著低于Cu+S處理，但在處理期間腐胺變化幅度不大。Cu脅迫下單獨(dú)添加外源0.1% Hb后，番茄根系中腐胺含量呈先上升后下降的趨勢，處理后6 h出現(xiàn)峰值，整個處理期間腐胺含量均低于Cu處理。

2.5 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系亞精胺含量的影響

如圖(5A)所示：Cu、Cu+S處理在整個處理期間葉片中亞精胺變化均呈先上升后下降的趨勢，且亞精胺含量均在處理后48 h出現(xiàn)峰值；各處理間在整個處理期間差異顯著。Cu處理期間葉片中除72 h外其余時間段亞精胺含量均高于對照。Cu+S處理期間亞精胺含量均高于Cu處理。同Cu+S處理相比，添加外源0.1% Hb后亞精胺含量變化呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，但下降和上升幅度均不大，整個處理期間亞精胺含量均低于Cu+S處理，且處理期間處理間異顯著。Cu+H處理下葉片中亞精胺含量先上升后下降，同Cu處理相比，整個處理期間亞精胺含量均低于Cu處理，各時間段處理間差異顯著。

圖(5B)根系中，Cu、Cu+S處理在整個處理期間亞精胺變化均呈先上升后下降的趨勢。Cu脅迫處理期間根系中亞精胺含量在處理后24 h出現(xiàn)峰值，除72 h外其余時間段均高于對照。Cu+S處理期間根系中亞精胺含量在處理后48h出現(xiàn)峰值，除處理后72 h外其余時間段根系中亞精胺含量均高于Cu處理。Cu+S處理?xiàng)l件下添加外源0.1% Hb，根系中亞精胺含量變化呈“降-升-降”趨勢，整個處理期間除72 h外其余時間段亞精胺含量均低于Cu+S處理。同Cu處理相比，添加外源0.1% Hb后根系中亞精胺含量變化趨勢與Cu+S處理相似，但整個處理期間亞精胺含量均低于Cu處理。處理期間處理間差異顯著。

圖5 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中亞精胺含量的影響Fig. 5 Effect of exogenous NO on Spermidine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

2.6 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系精胺含量的影響

如圖(6A)所示：Cu、Cu+S處理葉片和根系中精胺含量在處理期間均呈先上升后下降的趨勢，且精胺含量均在處理后48 h時出現(xiàn)峰值；外源SNP顯著增加Cu脅迫下根系和葉片中精胺含量。同CK相比，Cu處理?xiàng)l件下葉片和根系中精胺含量均高于對照，且處理期間處理間差異顯著。同Cu+S處理相比，添加外源0.1% Hb后葉片中精胺含量變化在處理期間呈“M”型趨勢，且在整個處理期間精胺含量均顯著低于Cu+S處理。同Cu處理相比，添加外源0.1% Hb后整個處理期間葉片中精胺含量變化先上升后下降，處理后6 h精胺含量出現(xiàn)峰值，且處理期間差異顯著。

根系中(6B)，同Cu+S處理相比，添加外源0.1% Hb后整個處理期間精胺含量呈先下降后上升趨勢，整個處理期間精胺含量均低于Cu+S處理，且在處理后24 h根系中精胺含量降至最，處理期間差異顯著。同Cu處理相比，添加外源0.1% Hb處理期間根系中精胺含量顯著降低，呈先下降后上升趨勢，處理后6 h根系中精胺含量降至最低，Cu處理與Cu+H處理處理間差異顯著。

2.7 外源NO對Cu脅迫下下番茄葉片和根系多胺總量的影響

如圖(7A、B)所示，Cu、Cu+S處理葉片和根系中多胺總量在處理期間均呈“∧”變化趨勢，處理期間多胺總量均高于CK。Cu脅迫條件下添加外源SNP能進(jìn)一步提高葉片和根系中多胺總量，Cu+S處理下添加外源0.1% Hb，處理期間葉片和根系中多胺總量顯著低于Cu+S處理，多胺總量變化呈“M”趨勢，數(shù)據(jù)分析顯示外源0.1% Hb能夠減弱SNP的效果。Cu脅迫下單獨(dú)添加外源0.1% Hb，葉片和根系中多胺總量急劇下降，整個處理期間葉片和根系中多胺總量均低于Cu處理。

2.8 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系NOS活性的影響

如圖(8A)所示，同CK相比，Cu脅迫處理期間葉片中NOS活性呈“ M ”型變化趨勢，處理后48 h葉片中NOS活性出現(xiàn)峰值，處理最初NOS活性最低；除處理期后1 h、6 h、72 h外，其余處理NOS活性均高于對照，各處理間差異顯著。同Cu處理相比，添加外源SNP處理期間NOS活性呈“降—升—降”趨勢，處理后6 h NOS活性達(dá)到最大值；處理后1-6 h期間NOS活性均高于Cu處理，6 h后至處理結(jié)束NOS活性均低于Cu處理，整個處理期間除24 h、48 h外，其它各處理間差異顯著。同Cu+S處理相比，添加外源0.1% Hb后葉片中NOS活性呈“降-升-降”趨勢，且在處理后24 h NOS活性出現(xiàn)峰值，除處理后1 h、24 h外其余處理期間NOS活性均低于Cu+S處理，除處理后1 h、48 h外，其余處理期間處理間差異均達(dá)到顯著水平。同Cu處理相比，添加外源0.1% Hb后葉片中NOS活性呈“ M ”趨勢，處理后48 h時NOS活性出現(xiàn)峰值，處理結(jié)束時NOS活性最低，除處理后1 h、6 h、48 h外其余處理期間NOS活性均低于Cu處理；除處理后6 h、24 h外，其余處理期間處理間差異均顯著。

圖6 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中精胺含量的影響Fig. 6 Effect of exogenous NO on Spermine contents in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

圖7 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中多胺總量的影響Fig. 7 Effect of exogenous NO on PAS contents in roots (A) and leaves (B) of tomato under copper stress

圖8 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中NOS活性的影響Fig. 8 Effect of exogenous NO on NOS activity in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

由圖(8B)看出，同CK相比，Cu脅迫處理期間根系中NOS活性呈“∧”趨勢，處理最初NOS活性最低，處理后6 h NOS活性出現(xiàn)峰值；除處理后1 h、3 h外，其余處理期間NOS活性均高于CK，除6 h、72 h外且各處理間差異均達(dá)到顯著水平。同Cu處理相比，添加外源SNP處理期間NOS活性呈“升-降-升”趨勢，處理后3 h NOS活性降至最低，處理結(jié)束時NOS活性最大；除處理后6 h外其余處理期間NOS活性均高于Cu處理，除處理后3 h、24 h外其余處理期間處理間差異均達(dá)到顯著水平。同Cu+S處理相比，添加外源0.1% Hb后根系中NOS活性呈“升-降-升-降”趨勢，除處理后48 h、72 h外，其余處理期間NOS活性均高于Cu+S處理；整個處理期間處理間差異均達(dá)到顯著水平。同Cu處理相比，添加外源0.1% Hb根系中NOS活性“N”趨勢，除24 h、48 h外，其余處理期間NOS活性均高于Cu處理；除處理后6 h、48 h外處理期間處理間差異均達(dá)到顯著水平。

2.9 外源NO對Cu脅迫下番茄葉片和根系NO釋放量的影響

由圖(9A、B)可看出，不同處理?xiàng)l件下，處理后1～6 h期間葉片和根系中NO釋放量變化呈相反趨勢，處理后6 h至處理結(jié)束NO釋放量變化趨勢相同。處理期間根系中NO釋放量普遍高于葉片。這可能是由于在脅迫初期，根系中大量消耗NO，葉片中NO向地下部運(yùn)輸，所以造成處理初期根系中NO含量高于葉片。

葉片中，處理后1～3 h期間葉片中NO釋放量急劇下降，處理后3～24 h期間NO釋放率逐步大幅上升，處理24h后NO釋放率趨于穩(wěn)定。除處理后3 h、48 h外，其余時間點(diǎn)各處理間差異均不顯著。葉片中SNP對NO釋放的促進(jìn)效果不明顯。

圖9 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗葉片(A)和根系(B)中NO釋放量的影響Fig. 9 Effect of exogenous NO on NO release amount in leaves (A) and roots (B) of tomato under copper stress

根系中，處理后1～3 h各處理葉片NO釋放量急劇上升，且在3 h時釋放量出現(xiàn)峰值，3～6 h間釋放量有所下降，但6 h后至24 h NO釋放量開始回升，且24 h后至處理結(jié)束NO釋放量的變化趨于穩(wěn)定。但相比與處理后3 h，處理后6 h至處理結(jié)束NO釋放相對降低。這說明外源SNP在處理初期能夠顯著增加根系中NO釋放量，隨著處理時間的延長SNP效果逐漸消失

2.10 外源NO對Cu脅迫下番茄生物量的影響

由表1可知：與CK相比，Cu脅迫下番茄幼苗地上部和根系鮮重顯著降低，分別下降66.7%, 62.7%；Cu脅迫下添加外源SNP番茄幼苗地上部和根系鮮重分別比單獨(dú)Cu脅迫處理增加77.9%和48.0%；Cu+S+H處理的番茄地上部鮮重與Cu+S處理相比顯著減少，而根系鮮重?zé)o明顯差異；Cu+H處理與單獨(dú)Cu處理相比，番茄地上部鮮重顯著下降，根系鮮重變化不明顯。

表1 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗生物量的影響

3 討論(Discussion)

L-精氨酸除作為植物體內(nèi)重要的氮素貯存物外，還是植物一氧化氮(NO)等信號分子的合成前體，L-精氨酸通過NOS途徑合成NO，NO參與植物體內(nèi)生理生化過程和生物非生物脅迫[19]。本試驗(yàn)中，Cu脅迫處理期間番茄根系和葉片中L-精氨酸含量高于對照，Cu脅迫下添加外源SNP后L-精氨酸含量進(jìn)一步提升，這與張敏等[20]研究一致。這說明，Cu脅迫下添加外源SNP能夠增加葉片和根系中L-精氨酸含量。精氨酸是植物體內(nèi)PA、NO合成前體，L-精氨酸在ADC、ODC作用下合成PA，或在NOS作用下合成NO。本研究中，銅脅迫條件下，添加外源SNP能夠調(diào)節(jié)L-精氨酸與PA，NO之間的合成關(guān)系，在根系中，銅脅迫下添加外源SNP能夠促進(jìn)L-精氨酸向PA合成方向進(jìn)行，促進(jìn)根系中PA的合成緩解重金屬對根系的傷害。而葉片中，銅脅迫下添加外源SNP后，L-精氨酸能夠同時向PA、NO合成進(jìn)行。

ADC、ODC是植物體內(nèi)L-精氨酸代謝過程中兩個關(guān)鍵酶。L-精氨酸在ADC/ODC的催化作用下合成多胺(圖10)，在各種逆境脅迫下如滲透、干旱和重金屬鹽漬等，植物體內(nèi)多胺水平均會發(fā)生一定變化[21-23]，以調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，提高其抗逆能力。研究發(fā)現(xiàn)[24]，鎘脅迫下能夠增加燕麥葉片、根系中腐胺含量，同時ADC活性也升高，但對Spd、Spm含量的影響較低或幾乎沒有影響。研究認(rèn)為[25]，Cu、Cd脅迫下水稻葉片中Put含量增加，但Spd含量沒有變化，Spm含量卻下降；Cu、Cd脅迫下水稻葉片ADC、ODC活性增加，進(jìn)而促進(jìn)PA的合成，PA的合成與ADC、ODC活性呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，與對照相比，Cu、Cu+S處理的根系和葉片中多胺含量隨處理隨時間延長呈上升趨勢，而多胺含量與ADC、ODC之間卻沒有嚴(yán)格的正相關(guān)關(guān)系。ADC、ODC在Cu處理期間葉片中處理處理后6 h兩種酶活性較低外，其余時間至少有一種酶的活性較高，根系中除24 h外也出現(xiàn)同時類似現(xiàn)象。而Cu脅迫下添加外源SNP后，除葉片中6 h ADC、ODC活性較低外，根系和葉片中在處理期間至少有一種酶活性較高，也就是說，外源SNP可能對ADC、ODC酶活性沒有直接影響，而是通過調(diào)節(jié)兩者之間的代謝關(guān)系進(jìn)而促進(jìn)多胺合成，而多胺又可以通過木質(zhì)部和韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)[26]，這就解釋了處理期間多胺合成過程中關(guān)鍵酶活雖然未同時升高，但根系和葉片中多胺含量卻呈上升趨勢的原因。Cu+S處理下添加外源0.1% Hb后，葉片中ADC、ODC均下降，而根系中這兩種酶活性較高。

圖10 植物體內(nèi)L-精氨酸代謝及協(xié)調(diào)多胺和NO的生物合成[16]Fig. 10 Ariginine metabolism and the coordinate biosynthesis of both polyamines and nitric oxide in plants[16]

NO可以通過一氧化氮合成酶(NOS)反應(yīng)生成。 研究發(fā)現(xiàn)[27]Cd脅迫下，水稻根系中NOS降低，NO釋放減少；Cd脅迫下添加外源SNP后提高NOS活性，NO釋放增加；Cd+SNP+CPTIO處理?xiàng)l件下NO釋放增加，NO釋放量與NOS活性呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，同CK相比，Cu脅迫下，處理后6 h根系中NOS活性升高，而內(nèi)源NO釋放在不同處理時間段與NOS活性相關(guān)關(guān)系不同；Cu+S處理下，NOS活性與NO釋放呈現(xiàn)正相關(guān)(R=0.42283)；Cu+S+H處理下根系和葉片中NOS活性與NO釋放在不同處理期間相關(guān)關(guān)系不同，這與[23]研究不一致，可能是由于處理方式不同造成的。葉片中，Cu+S處理下除處理后3 h、6 h外NOS活性與NO活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)外，其余時間段均呈正相關(guān)。因此，Cu脅迫下添加外源SNP后能夠上調(diào)NOS的活性，從而提高葉片中NO釋放量，提高番茄植株對Cu脅迫的緩解能力。根系和葉片多胺和NO合成過程中關(guān)鍵酶活性變化趨勢不同，可能由于番茄植株受到根系介質(zhì)中過多Cu脅迫時，與Cu直接接觸的根系首先會對脅迫做出防御性代謝反應(yīng)[28]。

PAs是一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，高等植物中常見的PAS有腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)、精胺(spermine，Spm)。多胺分子質(zhì)子化的氨基和亞氨基使其成為多聚陽離子，通過離子鍵和氫鍵形式與RNA、DNA、蛋白質(zhì)及帶負(fù)電荷基團(tuán)的磷脂等生物大分子相結(jié)合，促進(jìn)生長，提高種子活力和發(fā)芽力；刺激不定根產(chǎn)生，促進(jìn)根系對無機(jī)離子的吸收；延緩葉片衰老，延緩葉綠素的分解；提高抗逆性和抗?jié)B透脅迫[27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，外源SNP能夠同時增加番茄根系和葉片中腐胺、亞精胺、精胺的含量。亞精胺、精胺一方面能夠抑制磷脂雙分子層的反向運(yùn)動，另一方面穩(wěn)定細(xì)胞膜化合物[30,31]，除此之外，與亞精胺相比精胺含有四個氨基組能夠更有效的清除重金屬脅迫下產(chǎn)生的超氧化物，進(jìn)而緩解重金屬對番茄的毒害。而有研究認(rèn)為[32]，植物體內(nèi)若是積累過量的腐胺會產(chǎn)生硝化脅迫造成細(xì)胞死亡，但本研究中發(fā)現(xiàn)，銅脅迫下能夠積累腐胺，且隨著處理時間的延長腐胺的積累量越高，而植株并未表現(xiàn)出毒害現(xiàn)象，這可能是由于處理時間不同造成的。同時本研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫條件下添加外源SNP能夠顯著增加番茄地上部和地下部生物量，增加番茄對銅毒害的抵抗能力。

Cu脅迫下，NO介導(dǎo)了番茄L-精氨酸代謝途徑，并能夠通過調(diào)節(jié)根系和葉片中ADC, ODC, NOS活性，調(diào)控NO和PA的代謝方向。外源SNP通過上調(diào)ADC, ODC活性，促進(jìn)Cu脅迫下番茄根系L-精氨酸向PA合成方向進(jìn)行；在葉片中外源SNP則通過上調(diào)ADC, ODC及NOS活性促進(jìn) PA和NO合成，從而緩解Cu對番茄生長的抑制。

致謝：感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)學(xué)院裘老師幫助和支持。

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◆

The Effect of Exogenous NO on L-arginine Metabolism in Tomato Seedlings under Copper Stress

Wang Jian1，Yu Shixin，Dou Qiaohui, Wang Yijun, Cui Xiumin*

National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Resources and Environment, Shandong Agricultural University, Taian 271018 China

Received 25 April 2014 accepted 17 August 2014

Nitric oxide (NO), as a bioactive molecule, widely involved in both biotic and abiotic stresses. Using solution culture, this paper reported responding mechanism of L-arginine, NO and Polyamine (PA) metabolism to exogenous NO in tomato seedlings under copper stress. This would hopefully provide scientific basis and technical support for the copper polluted land. These results suggested that adding exogenous SNP(Sodium Nitroprusside, Exogenous NO donor)could modulate the Arginine Decarboxylase (ADC), Ornithine Decarboxylase (ODC) and Nitric Oxide Synthase (NOS) activity in tomato root and leaf under copper stress. In the root, exogenous SNP could increase the NOS activity, which induced L-arginine metabolism toward the direction of NO synthesis. In the leaf, exogenous SNP also enhanced the activity of ADC, ODC and NOS, meanwhile the synthesis of PA and NO was promoted. In addition, adding exogenous SNP could increase L-arginine content in tomato. As an synthetic precursor of PA and NO, arginine content rising would undoubtedly indirectly promote the PA and NO synthesis, thus improved the tomato resistance under copper stress.

copper stress; tomato; nitric oxide; L-Arginine; polyamine

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201619)

王建(1987-)，男，碩士研究生；研究方向：植物營養(yǎng)機(jī)理與調(diào)控；E-mail：wj308119@sina.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xiumincui@sdau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140425002

2014-04-25 錄用日期：2014-08-17

1673-5897(2015)3-112-11

X171.5

A

崔秀敏(1977—)，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹参餇I養(yǎng)機(jī)理與調(diào)控。

王建，竇巧惠，于世欣, 等. 外源NO對Cu脅迫下番茄幼苗L-精氨酸代謝的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(3): 112-122

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