黃 娟，雍小蘭*，馮仕銀，王藍(lán)天，李 楠，杜曉琳

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HPLC-MS/MS法測定人尿液中戊乙奎醚的濃度

黃 娟1,2，雍小蘭1,2*，馮仕銀2，王藍(lán)天2，李 楠2，杜曉琳2

目的 建立測定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS法。方法 尿樣經(jīng)稀釋，離心后取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS測定。色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相：5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式多重反應(yīng)選擇離子檢測(MRM)。戊乙奎醚和內(nèi)標(biāo)的定量離子對分別為m/z 316.2→128.1和m/z 256.2→167.1。結(jié)果 線性范圍為1～100 ng/mL(r=0.997 7)，最低定量限為1 ng/mL，日內(nèi)和日間精密度(RSD)均<7.9%。結(jié)論 本方法簡單、快速、靈敏、專屬性高，適用于人尿液中戊乙奎醚藥動學(xué)的研究。

戊乙奎醚；HPLC-MS/MS；尿液濃度；藥動學(xué)

0 引言

鹽酸戊乙奎醚(Penehyclidine hydrochloride，簡稱PH)是一種新型的抗膽堿藥，對中樞神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M、N樣作用，對外周神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M樣作用和一定程度的抗N樣作用。其選擇性作用于M1、M3和N1、N2亞型受體，對M2亞型無明顯作用。近年來主要應(yīng)用于對抗有機(jī)磷中毒、麻醉前用藥、胃腸平滑肌解痙、抑制膀胱收縮及減輕鼻粘膜水腫等[1]。國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道測定血漿和動物尿液中戊乙奎醚濃度的方法[2-6]，但測定人尿液中戊乙奎醚濃度的文獻(xiàn)很少[7]。鑒于此，本試驗(yàn)擬建立測定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS方法，為臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

API3200型液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB公司)；LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；AB135-S型十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Thermo ST16R型冷凍離心機(jī)(美國熱電)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；-80 ℃低溫冰箱(中國海爾公司)。

鹽酸戊乙奎醚對照品(成都力思特制藥股份有限公司，批號：090701，純度：99.9%)；鹽酸苯海拉明對照品(Diphenhydramine hydrochloride，DH，中國藥品生物制品檢定所，批號：033k0106)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式多重反應(yīng)選擇離子檢測(MRM)，離子源噴霧電壓為5 500 V，干燥溫度為550 ℃，碰撞氣壓力為70 kPa，霧化氣壓力為44 kPa。用于定量分析的離子對分別為m/z 316.2→128.1(PH)，m/z 256.2→167.1(DH)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相：5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH至5.5)-甲醇(35∶65，v/v)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法專屬性 在“2.1”、“2.2”項(xiàng)色譜/質(zhì)譜條件下，戊乙奎醚(A)及內(nèi)標(biāo)苯海拉明(B)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1?？瞻啄蛞骸⒖瞻啄蛞褐屑尤隤H和DH，受試者尿液的典型色譜圖見圖2。由圖2可見，PH的保留時間為2.14 min，DH保留時間為1.97 min，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾測定。

圖1 PH(A)和DH(B)的二級全掃描質(zhì)譜圖

2.4 溶液的配制 對照品溶液：精密稱取鹽酸戊乙奎醚對照品13.88 mg(相當(dāng)于戊乙奎醚12.5 mg)置25 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg/mL的PH儲備液。取PH儲備液，用純水依次稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取鹽酸苯海拉明對照品11.58 mg(相當(dāng)于苯海拉明10.05 mg)，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為100 μg/mL的DH儲備液。取DH儲備液，用純水稀釋成20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 典型色譜圖

2.5 受試者選擇 健康受試者12例，男女各半，年齡21～24(23±1)歲，身高155～180(166±8)cm，體重指數(shù)19.05～23.31(21.22±1.45)kg/m2。所有受試者在試驗(yàn)前、后均進(jìn)行常規(guī)體檢、心電圖和血液生化檢查，受試者心、肝、腎功能未見異常。試驗(yàn)經(jīng)成都軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批通過。全面健康體檢合格后，受試者充分了解本試驗(yàn)的目的和要求，志愿受試，并簽署知情同意書。

2.6 尿液樣品處理 取冷凍尿液樣品室溫自然解凍，精密吸取尿液樣品50 μL于2.0 mL塑料管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和純水500 μL，渦旋混勻，10 000 r/min離心10 min(離心半徑16 cm)，取上清液100 μL于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.7 樣品測定

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 于8份50 μL空白尿液中分別加入系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，混勻，使PH尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為1、2.5、5、10、20、40、80、100 ng/mL。其余按“2.5”項(xiàng)下方法處理，以PH峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)與PH尿液濃度(X，ng/mL)進(jìn)行加權(quán)線性回歸，得回歸方程：Y=0.035 5 X +0.008 2(r=0.997 7)。結(jié)果表明，PH濃度在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng/mL。定量下限的精密度和準(zhǔn)確度分別為：7.06%和110.49%(n=7)。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 分別配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3個濃度的質(zhì)控尿液樣本，各7份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

2.7.3 基質(zhì)效應(yīng)[8]按“2.5”項(xiàng)下以純水代替空白尿樣處理3個低濃度質(zhì)控(2.5 ng/mL)，進(jìn)樣后所得峰面積為A，再按“2.5”項(xiàng)下用6個不同來源的空白尿樣各3個共18個處理低濃度質(zhì)控(2.5 ng/mL)，進(jìn)樣后所得峰面積為B，按公式A/B×100%計算，分別得到PH和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)因子MF1和MF2，按MF1/MF2計算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。所得6個內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子的變異系數(shù)為3.61%，符合歐盟指導(dǎo)原則[9]要求的小于±15%。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3個濃度的質(zhì)控尿液樣本。按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察了尿液樣本反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性，室溫放置10 h穩(wěn)定性，進(jìn)樣室放置(10 ℃)5 h穩(wěn)定性，以及-80 ℃冷凍放置103 d穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，PH的濃度均保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化。

2.8 方法應(yīng)用 健康受試者試驗(yàn)前禁食12 h，試驗(yàn)當(dāng)日清晨空腹用200 mL溫開水吞服0.6 mg鹽酸戊乙奎醚片，分別于給藥前及給藥后0～2、2～4、4～8、8～12、12～24、24～36、36～48 h收集受試者的全部尿液，將各時間段的尿液混勻測量體積后，分別取1.5 mL于塑料管中，置-80 ℃低溫保存待測。冷凍尿液樣品按“2.5”項(xiàng)下方法處理并測定，12個受試者不同時間段測得的尿藥累積排泄率-時間曲線見圖3。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖3 PH尿藥累積排泄率-時間曲線(n=12)

3 討論

鹽酸戊乙奎醚為堿性藥物，文獻(xiàn)報道多在流動相中添加三乙胺[6]，試驗(yàn)中嘗試了在流動相中添加掃尾劑三乙胺，但三乙胺使檢測的靈敏度嚴(yán)重下降。經(jīng)嘗試不同濃度的醋酸銨鹽溶液和酸堿度，綜合考慮，確定流動相為5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，此條件下藥物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形對稱，相對分子離子峰強(qiáng)度高，有足夠的靈敏度，能滿足檢測的要求。

已報道的測定小鼠及人尿液中戊乙奎醚濃度的樣品前處理方法多為液液萃取[5-7]，本試驗(yàn)采用直接稀釋后離心的方法處理樣品，操作簡單，能滿足尿液樣品的檢測要求。本試驗(yàn)建立的測定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS法專屬性強(qiáng)，

準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，操作簡單，可快速準(zhǔn)確地測定人尿液中戊乙奎醚的濃度。

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Determination of penehyclidine in human urine by HPLC-MS/MS

HUANG Juan1,2,YONG Xiao-lan1,2*，F(xiàn)ENG Shi-yin2,WANG Lan-tian2,LI Nan2,DU Xiao-lin2

(1.School of Chemical Engineering,Sichun University,Chengdu 610065,China;2.Department of Clinical Pharmacy,Chengdu Military General Hospital,Chengdu 610083,China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for determination of penehyclidine in human urine.Methods The supernatant liquid obtained from the diluted urine centrifugate was subjected to sample introduction and was analyzed by the HPLC-MS/MS method under flowing chromatographic conditions∶Agilent ZORBAX Bonus-RP column (4.6 mm×150 mm,5 μm),the mobile phase compositing with 5 mM ammonium acetate (pH was adjusted to 5.5 by formic acid):methanol (35∶65，v/v),with a rate of 1.0 mL/min,column temperature at 30 ℃,and injected sample volume of 10 μL.The results of positive ion MRM detection of penehyclidine and internal standards were m/z 316.2→128.1 and m/z 256.2→167.1.Results The calibration curve was linear over the concentration range of 1～100 ng/mL(r=0.997 7)with the lower limit of quantitation (LLOQ) 1 ng/mL.The intra-dayRSDand inter-dayRSDwere all below 7.9%.Conclusion The method is simple,rapid,specific and sensitive,it can be used for the pharmacokinetic study of penehyclidinein human urine.

Penehyclidine;HPLC-MS/MS;Urine concentration;Pharmacokinetics

2015-03-25

1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，成都 610065；2.中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，成都 610083

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511022