黃 娟，雍小蘭*，馮仕銀，王藍(lán)天，李 楠，杜曉琳

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HPLC-MS/MS法測(cè)定人尿液中戊乙奎醚的濃度

黃 娟1,2，雍小蘭1,2*，馮仕銀2，王藍(lán)天2，李 楠2，杜曉琳2

目的 建立測(cè)定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS法。方法 尿樣經(jīng)稀釋?zhuān)x心后取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定。色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動(dòng)相：5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式多重反應(yīng)選擇離子檢測(cè)(MRM)。戊乙奎醚和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)分別為m/z 316.2→128.1和m/z 256.2→167.1。結(jié)果 線性范圍為1～100 ng/mL(r=0.997 7)，最低定量限為1 ng/mL，日內(nèi)和日間精密度(RSD)均<7.9%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、專(zhuān)屬性高，適用于人尿液中戊乙奎醚藥動(dòng)學(xué)的研究。

戊乙奎醚；HPLC-MS/MS；尿液濃度；藥動(dòng)學(xué)

0 引言

鹽酸戊乙奎醚(Penehyclidine hydrochloride，簡(jiǎn)稱(chēng)PH)是一種新型的抗膽堿藥，對(duì)中樞神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M、N樣作用，對(duì)外周神經(jīng)有較強(qiáng)的抗M樣作用和一定程度的抗N樣作用。其選擇性作用于M1、M3和N1、N2亞型受體，對(duì)M2亞型無(wú)明顯作用。近年來(lái)主要應(yīng)用于對(duì)抗有機(jī)磷中毒、麻醉前用藥、胃腸平滑肌解痙、抑制膀胱收縮及減輕鼻粘膜水腫等[1]。國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定血漿和動(dòng)物尿液中戊乙奎醚濃度的方法[2-6]，但測(cè)定人尿液中戊乙奎醚濃度的文獻(xiàn)很少[7]。鑒于此，本試驗(yàn)擬建立測(cè)定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS方法，為臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

API3200型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AB公司)；LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Thermo ST16R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)熱電)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；-80 ℃低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)。

鹽酸戊乙奎醚對(duì)照品(成都力思特制藥股份有限公司，批號(hào)：090701，純度：99.9%)；鹽酸苯海拉明對(duì)照品(Diphenhydramine hydrochloride，DH，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：033k0106)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式多重反應(yīng)選擇離子檢測(cè)(MRM)，離子源噴霧電壓為5 500 V，干燥溫度為550 ℃，碰撞氣壓力為70 kPa，霧化氣壓力為44 kPa。用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 316.2→128.1(PH)，m/z 256.2→167.1(DH)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相：5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH至5.5)-甲醇(35∶65，v/v)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法專(zhuān)屬性 在“2.1”、“2.2”項(xiàng)色譜/質(zhì)譜條件下，戊乙奎醚(A)及內(nèi)標(biāo)苯海拉明(B)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。空白尿液、空白尿液中加入PH和DH，受試者尿液的典型色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，PH的保留時(shí)間為2.14 min，DH保留時(shí)間為1.97 min，無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾測(cè)定。

圖1 PH(A)和DH(B)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

2.4 溶液的配制 對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取鹽酸戊乙奎醚對(duì)照品13.88 mg(相當(dāng)于戊乙奎醚12.5 mg)置25 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為500 μg/mL的PH儲(chǔ)備液。取PH儲(chǔ)備液，用純水依次稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取鹽酸苯海拉明對(duì)照品11.58 mg(相當(dāng)于苯海拉明10.05 mg)，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為100 μg/mL的DH儲(chǔ)備液。取DH儲(chǔ)備液，用純水稀釋成20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 典型色譜圖

2.5 受試者選擇 健康受試者12例，男女各半，年齡21～24(23±1)歲，身高155～180(166±8)cm，體重指數(shù)19.05～23.31(21.22±1.45)kg/m2。所有受試者在試驗(yàn)前、后均進(jìn)行常規(guī)體檢、心電圖和血液生化檢查，受試者心、肝、腎功能未見(jiàn)異常。試驗(yàn)經(jīng)成都軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。全面健康體檢合格后，受試者充分了解本試驗(yàn)的目的和要求，志愿受試，并簽署知情同意書(shū)。

2.6 尿液樣品處理 取冷凍尿液樣品室溫自然解凍，精密吸取尿液樣品50 μL于2.0 mL塑料管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和純水500 μL，渦旋混勻，10 000 r/min離心10 min(離心半徑16 cm)，取上清液100 μL于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.7 樣品測(cè)定

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 于8份50 μL空白尿液中分別加入系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，混勻，使PH尿液標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為1、2.5、5、10、20、40、80、100 ng/mL。其余按“2.5”項(xiàng)下方法處理，以PH峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)與PH尿液濃度(X，ng/mL)進(jìn)行加權(quán)線性回歸，得回歸方程：Y=0.035 5 X +0.008 2(r=0.997 7)。結(jié)果表明，PH濃度在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng/mL。定量下限的精密度和準(zhǔn)確度分別為：7.06%和110.49%(n=7)。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 分別配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控尿液樣本，各7份，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

2.7.3 基質(zhì)效應(yīng)[8]按“2.5”項(xiàng)下以純水代替空白尿樣處理3個(gè)低濃度質(zhì)控(2.5 ng/mL)，進(jìn)樣后所得峰面積為A，再按“2.5”項(xiàng)下用6個(gè)不同來(lái)源的空白尿樣各3個(gè)共18個(gè)處理低濃度質(zhì)控(2.5 ng/mL)，進(jìn)樣后所得峰面積為B，按公式A/B×100%計(jì)算，分別得到PH和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)因子MF1和MF2，按MF1/MF2計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。所得6個(gè)內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子的變異系數(shù)為3.61%，符合歐盟指導(dǎo)原則[9]要求的小于±15%。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控尿液樣本。按“2.5”項(xiàng)下方法處理，考察了尿液樣本反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性，室溫放置10 h穩(wěn)定性，進(jìn)樣室放置(10 ℃)5 h穩(wěn)定性，以及-80 ℃冷凍放置103 d穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，PH的濃度均保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化。

2.8 方法應(yīng)用 健康受試者試驗(yàn)前禁食12 h，試驗(yàn)當(dāng)日清晨空腹用200 mL溫開(kāi)水吞服0.6 mg鹽酸戊乙奎醚片，分別于給藥前及給藥后0～2、2～4、4～8、8～12、12～24、24～36、36～48 h收集受試者的全部尿液，將各時(shí)間段的尿液混勻測(cè)量體積后，分別取1.5 mL于塑料管中，置-80 ℃低溫保存待測(cè)。冷凍尿液樣品按“2.5”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，12個(gè)受試者不同時(shí)間段測(cè)得的尿藥累積排泄率-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖3 PH尿藥累積排泄率-時(shí)間曲線(n=12)

3 討論

鹽酸戊乙奎醚為堿性藥物，文獻(xiàn)報(bào)道多在流動(dòng)相中添加三乙胺[6]，試驗(yàn)中嘗試了在流動(dòng)相中添加掃尾劑三乙胺，但三乙胺使檢測(cè)的靈敏度嚴(yán)重下降。經(jīng)嘗試不同濃度的醋酸銨鹽溶液和酸堿度，綜合考慮，確定流動(dòng)相為5 mM醋酸銨(甲酸調(diào)pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，此條件下藥物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)，相對(duì)分子離子峰強(qiáng)度高，有足夠的靈敏度，能滿足檢測(cè)的要求。

已報(bào)道的測(cè)定小鼠及人尿液中戊乙奎醚濃度的樣品前處理方法多為液液萃取[5-7]，本試驗(yàn)采用直接稀釋后離心的方法處理樣品，操作簡(jiǎn)單，能滿足尿液樣品的檢測(cè)要求。本試驗(yàn)建立的測(cè)定人尿液中戊乙奎醚濃度的HPLC-MS/MS法專(zhuān)屬性強(qiáng)，

準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單，可快速準(zhǔn)確地測(cè)定人尿液中戊乙奎醚的濃度。

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Determination of penehyclidine in human urine by HPLC-MS/MS

HUANG Juan1,2,YONG Xiao-lan1,2*，F(xiàn)ENG Shi-yin2,WANG Lan-tian2,LI Nan2,DU Xiao-lin2

(1.School of Chemical Engineering,Sichun University,Chengdu 610065,China;2.Department of Clinical Pharmacy,Chengdu Military General Hospital,Chengdu 610083,China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for determination of penehyclidine in human urine.Methods The supernatant liquid obtained from the diluted urine centrifugate was subjected to sample introduction and was analyzed by the HPLC-MS/MS method under flowing chromatographic conditions∶Agilent ZORBAX Bonus-RP column (4.6 mm×150 mm,5 μm),the mobile phase compositing with 5 mM ammonium acetate (pH was adjusted to 5.5 by formic acid):methanol (35∶65，v/v),with a rate of 1.0 mL/min,column temperature at 30 ℃,and injected sample volume of 10 μL.The results of positive ion MRM detection of penehyclidine and internal standards were m/z 316.2→128.1 and m/z 256.2→167.1.Results The calibration curve was linear over the concentration range of 1～100 ng/mL(r=0.997 7)with the lower limit of quantitation (LLOQ) 1 ng/mL.The intra-dayRSDand inter-dayRSDwere all below 7.9%.Conclusion The method is simple,rapid,specific and sensitive,it can be used for the pharmacokinetic study of penehyclidinein human urine.

Penehyclidine;HPLC-MS/MS;Urine concentration;Pharmacokinetics

2015-03-25

1.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，成都 610065；2.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，成都 610083

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511022