作者單位:650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科(唐　冰,周婭琳),腎病內(nèi)科(韓　敬)

唐　冰,周婭琳,韓　敬

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HPLC法測(cè)定人血漿中克林霉素含量及其藥動(dòng)學(xué)研究

作者單位:650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科(唐冰,周婭琳),腎病內(nèi)科(韓敬)

唐冰,周婭琳,韓敬

[摘要]目的建立人血漿中克林霉素的HPLC檢測(cè)方法。方法采用HPLC法檢測(cè)人血漿中克林霉素含量,檢測(cè)條件為:色譜柱:Inertsil? DOS-3 C185 μm硅膠柱(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相:乙腈/0.05 M KH2PO4=30/70(v/v),流速:1 ml/min；柱溫:35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):204 nm,進(jìn)樣量為100 μl。結(jié)果血漿中克林霉素濃度在0.20~16.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9992~0.9998),最低檢測(cè)濃度為0.20 μg/ml,方法學(xué)回收率為82.42%~89.37%,日內(nèi)及日間精密度RSD<15%。結(jié)論此方法專屬、準(zhǔn)確、靈敏度高,樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)便,適合克林霉素臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]克林霉素；檢測(cè)；HPLC；血漿；藥代動(dòng)力學(xué)

目前檢測(cè)人血漿中克林霉素含量的常用方法有HPLCS法和LC/MS/M法。所報(bào)道的HPLC法,需要經(jīng)過(guò)固相萃取這一步驟[1-3],檢測(cè)操作較為繁瑣,保留時(shí)間較長(zhǎng)；而LC/MS/MS法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確[4-5]、重現(xiàn)性好、精密度高,但其由于檢測(cè)儀器的價(jià)格較高,難以推廣應(yīng)用。本研究探討了直接采用HPLC-UV法檢測(cè)人血漿中的克林霉素,以適合克林霉素臨床樣本檢測(cè)的需求。

1儀器與材料

1.1儀器Waters 2690型高效液相色譜儀:包括2695溶劑輸送系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、2487雙通道紫外檢測(cè)器、柱溫箱、Empower數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Waters公司)；BP121S電子天平(德國(guó)賽多利斯)；LDZ-5-2型自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京離心機(jī)廠)；AS2060B型超聲波清洗儀(美國(guó)AUTOSCIENCE)；XW-80A型漩渦混合器Vortex(上海精科)；Texas 75062高速離心機(jī)(美國(guó)雅培)。

1.2試劑鹽酸克林霉素膠囊(上海新亞藥業(yè))；鹽酸克林霉素對(duì)照品(含量>99.5%,上海新亞藥業(yè))；奈韋拉平對(duì)照品(內(nèi)標(biāo),純度99.5%,蘇州百拓)；空白血漿(本院輸血科提供)；乙腈(色譜純,美國(guó)默克)；二氯甲烷(色譜純,美國(guó)TEDIA,批號(hào):504071)；甲醇(色譜純,美國(guó)默克)；超純水(Milli-Q)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱:Inertsil DOS-3 C185 μm柱(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相:乙腈/0.05 M KH2PO4,流速:1 ml/min；柱溫:35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):204 nm,進(jìn)樣量為100 μl。

2.2貯備液及工作液配制

2.2.1鹽酸克林霉素儲(chǔ)備液精密稱取鹽酸克林霉素對(duì)照品10.0 mg于10 ml量瓶中,用水溶解并定容配成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液,置4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2內(nèi)標(biāo)奈韋拉平儲(chǔ)備液精密稱取奈韋拉平對(duì)照品10 mg于10 ml量瓶中,用水溶解并定容配成濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液,置4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血漿樣本的處理于0.5 ml血漿中分別加入50 μl內(nèi)標(biāo)溶液(10 μg/ml奈韋拉平儲(chǔ)備液),100 μl氫氧化鈉溶液(0.4 mol/L),渦流混合0.5 min,定量加入二氯甲烷3.5 ml,渦流混合1 min,離心(5000 r/min)5 min后,棄上層,留下層40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?；用流?dòng)相200 μl溶解殘?jiān)?渦流混合1 min離心(10 000 r/min)5 min,取上清液150 μl置于進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi),進(jìn)樣50 μl進(jìn)行分析,記錄色譜圖。

2.4特異性采用2.3處理步驟分別處理空白血漿、空白血漿+克林霉素對(duì)照品、給藥后1 h的受試者的血漿樣品、以及配制的最低檢測(cè)濃度血漿樣品,以2.1色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè),其色譜圖見(jiàn)圖1。鹽酸克林霉素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為6.1 min和8.5 min。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾鹽酸克林霉素和內(nèi)標(biāo)奈韋拉平的測(cè)定。

圖1　測(cè)定血漿中鹽酸克林霉素及內(nèi)標(biāo)奈韋拉平色譜圖

A:空白血清色譜圖；B:空白血清加10 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；C:空白血清加40 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)色譜圖；D:最低檢測(cè)限0.25 μg/ml色譜圖(drug:克林霉素；is:內(nèi)標(biāo))；E:給藥血漿樣品色譜圖(受試者用藥后1 h血樣,左邊峰為克林霉素,右邊為內(nèi)標(biāo))

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線在健康人空白血清中精密加入不同量的鹽酸克林霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其濃度分別為0.2、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml。按樣品處理與測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,以樣品濃度(X)與鹽酸克林霉素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)進(jìn)行回歸,得回歸方程:Y=0.5980X+0.0140,R=0.9992,表明鹽酸克林霉素在0.2~16 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(圖2)。

圖2　HPLC法測(cè)定人血漿中克林霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6最低定量限檢測(cè)限按基線噪音3倍計(jì)算,并符合精密度和準(zhǔn)確度的要求,本方法的最低檢測(cè)濃度為0.20 μg/ml,RSD<10%。

2.7精密度在空白人血清中加入不同量的鹽酸克林霉素配制成低、中、高(0.5、2、16 μg/ml)不同濃度的質(zhì)控血樣,每個(gè)濃度各6個(gè)樣品,按上述條件分別測(cè)定日內(nèi)、日間變異,結(jié)果見(jiàn)表1。其RSD<15%,符合檢測(cè)要求。

2.8方法學(xué)回收率在空白血漿中加入克林霉素儲(chǔ)備液,配制成高、中、低3個(gè)濃度點(diǎn)(0.5、2.0、16.0 g/ml)的質(zhì)控樣品,按2.3“血漿樣品處理”項(xiàng)下的方法處理,每個(gè)濃度平行分析6個(gè)樣本。以實(shí)際測(cè)得的峰面積與儲(chǔ)備液配制的相同濃度測(cè)得的峰面積的比計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　血漿中鹽酸克林霉素HPLC測(cè)定方法的精密度與

2.9樣品穩(wěn)定性考察

2.9.1血樣保存穩(wěn)定性配制成高、中、低3個(gè)濃度點(diǎn)(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品,在-80 ℃冰箱貯存,分別于0、30、60及90 d檢測(cè)血藥濃度,結(jié)果表明,血樣中克林霉素含量變化RSD<15%。

2.9.2血樣放置穩(wěn)定性配制成高、中、低3個(gè)濃度點(diǎn)(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品,分別存放于-4 ℃和室溫條件,分別于0、2、4、6和8 h檢測(cè)血藥濃度,結(jié)果表明,血樣中克林霉素含量變化RSD<15%。

2.9.3血樣凍融穩(wěn)定性將高、中、低3個(gè)濃度點(diǎn)(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品分別凍融6次(-80 ℃冷凍,室溫下融化)后檢測(cè)其濃度,含量變化RSD<15%,結(jié)果表明反復(fù)凍融對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響。

2.10藥動(dòng)學(xué)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),篩選20名健康志愿受試者口服鹽酸克林霉素膠囊300 mg,測(cè)定其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為:平均t1/2為(2.26±0.55)h,平均Cmax為(3.24±1.26)μg/ml,平均達(dá)峰時(shí)間Tmax為(1.09±0.42)h,平均AUC(0-t)和AUC(0-∞)分別為(11.86±5.56)和(12.18±5.64)μg/(ml·h),平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。

圖320名受試者單次口服克林霉素300 mg后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3討論

本研究從特異性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及方法學(xué)回收率等方面進(jìn)行了較為全面的方法學(xué)確證,所有檢測(cè)RSD均低于15%,符合人體血漿檢測(cè)方法學(xué)的要求[6]。將其用于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究,取得了較為理想的結(jié)果,所得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致。研究中發(fā)現(xiàn),如果當(dāng)流動(dòng)相pH值在6.5~6.8范圍內(nèi),克林霉素的出峰時(shí)間比較穩(wěn)定。

研究結(jié)果證實(shí),本研究所建立的HPLC-UV法檢測(cè)人血漿中的克林霉素含量方法,專屬性、準(zhǔn)確性、靈敏度高,重現(xiàn)性好,樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)便,適合克林霉素臨床檢測(cè)需求。

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[6]《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[M/OL].2005,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心網(wǎng)站頒布,http://www.cde.org.cn/zdyz.do?method=largePage&id=2070

(收稿日期:2014-11-03)

文章編號(hào)1004-0188(2015)03-0299-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.026

中圖分類號(hào)R 927.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A