作者單位:650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科(唐　冰,周婭琳),腎病內(nèi)科(韓　敬)

唐　冰,周婭琳,韓　敬

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HPLC法測定人血漿中克林霉素含量及其藥動學(xué)研究

作者單位:650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科(唐冰,周婭琳),腎病內(nèi)科(韓敬)

唐冰,周婭琳,韓敬

[摘要]目的建立人血漿中克林霉素的HPLC檢測方法。方法采用HPLC法檢測人血漿中克林霉素含量,檢測條件為:色譜柱:Inertsil? DOS-3 C185 μm硅膠柱(250 mm×4.6 mm)；流動相:乙腈/0.05 M KH2PO4=30/70(v/v),流速:1 ml/min；柱溫:35 ℃,檢測波長:204 nm,進樣量為100 μl。結(jié)果血漿中克林霉素濃度在0.20~16.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9992~0.9998),最低檢測濃度為0.20 μg/ml,方法學(xué)回收率為82.42%~89.37%,日內(nèi)及日間精密度RSD<15%。結(jié)論此方法專屬、準(zhǔn)確、靈敏度高,樣品處理過程簡便,適合克林霉素臨床藥代動力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]克林霉素；檢測；HPLC；血漿；藥代動力學(xué)

目前檢測人血漿中克林霉素含量的常用方法有HPLCS法和LC/MS/M法。所報道的HPLC法,需要經(jīng)過固相萃取這一步驟[1-3],檢測操作較為繁瑣,保留時間較長；而LC/MS/MS法檢測結(jié)果準(zhǔn)確[4-5]、重現(xiàn)性好、精密度高,但其由于檢測儀器的價格較高,難以推廣應(yīng)用。本研究探討了直接采用HPLC-UV法檢測人血漿中的克林霉素,以適合克林霉素臨床樣本檢測的需求。

1儀器與材料

1.1儀器Waters 2690型高效液相色譜儀:包括2695溶劑輸送系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器、2487雙通道紫外檢測器、柱溫箱、Empower數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Waters公司)；BP121S電子天平(德國賽多利斯)；LDZ-5-2型自動平衡離心機(北京離心機廠)；AS2060B型超聲波清洗儀(美國AUTOSCIENCE)；XW-80A型漩渦混合器Vortex(上海精科)；Texas 75062高速離心機(美國雅培)。

1.2試劑鹽酸克林霉素膠囊(上海新亞藥業(yè))；鹽酸克林霉素對照品(含量>99.5%,上海新亞藥業(yè))；奈韋拉平對照品(內(nèi)標(biāo),純度99.5%,蘇州百拓)；空白血漿(本院輸血科提供)；乙腈(色譜純,美國默克)；二氯甲烷(色譜純,美國TEDIA,批號:504071)；甲醇(色譜純,美國默克)；超純水(Milli-Q)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱:Inertsil DOS-3 C185 μm柱(250 mm×4.6 mm)；流動相:乙腈/0.05 M KH2PO4,流速:1 ml/min；柱溫:35 ℃,檢測波長:204 nm,進樣量為100 μl。

2.2貯備液及工作液配制

2.2.1鹽酸克林霉素儲備液精密稱取鹽酸克林霉素對照品10.0 mg于10 ml量瓶中,用水溶解并定容配成濃度為1.0 mg/ml的儲備液,置4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2內(nèi)標(biāo)奈韋拉平儲備液精密稱取奈韋拉平對照品10 mg于10 ml量瓶中,用水溶解并定容配成濃度為1.0 mg/ml的儲備液,置4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血漿樣本的處理于0.5 ml血漿中分別加入50 μl內(nèi)標(biāo)溶液(10 μg/ml奈韋拉平儲備液),100 μl氫氧化鈉溶液(0.4 mol/L),渦流混合0.5 min,定量加入二氯甲烷3.5 ml,渦流混合1 min,離心(5000 r/min)5 min后,棄上層,留下層40 ℃水浴氮氣吹干；用流動相200 μl溶解殘渣,渦流混合1 min離心(10 000 r/min)5 min,取上清液150 μl置于進樣小瓶內(nèi),進樣50 μl進行分析,記錄色譜圖。

2.4特異性采用2.3處理步驟分別處理空白血漿、空白血漿+克林霉素對照品、給藥后1 h的受試者的血漿樣品、以及配制的最低檢測濃度血漿樣品,以2.1色譜條件分別進樣檢測,其色譜圖見圖1。鹽酸克林霉素和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別約為6.1 min和8.5 min。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾鹽酸克林霉素和內(nèi)標(biāo)奈韋拉平的測定。

圖1　測定血漿中鹽酸克林霉素及內(nèi)標(biāo)奈韋拉平色譜圖

A:空白血清色譜圖；B:空白血清加10 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；C:空白血清加40 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)色譜圖；D:最低檢測限0.25 μg/ml色譜圖(drug:克林霉素；is:內(nèi)標(biāo))；E:給藥血漿樣品色譜圖(受試者用藥后1 h血樣,左邊峰為克林霉素,右邊為內(nèi)標(biāo))

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線在健康人空白血清中精密加入不同量的鹽酸克林霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其濃度分別為0.2、0.5、1、2、4、8、16 μg/ml。按樣品處理與測定方法進行測定,以樣品濃度(X)與鹽酸克林霉素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)進行回歸,得回歸方程:Y=0.5980X+0.0140,R=0.9992,表明鹽酸克林霉素在0.2~16 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(圖2)。

圖2　HPLC法測定人血漿中克林霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6最低定量限檢測限按基線噪音3倍計算,并符合精密度和準(zhǔn)確度的要求,本方法的最低檢測濃度為0.20 μg/ml,RSD<10%。

2.7精密度在空白人血清中加入不同量的鹽酸克林霉素配制成低、中、高(0.5、2、16 μg/ml)不同濃度的質(zhì)控血樣,每個濃度各6個樣品,按上述條件分別測定日內(nèi)、日間變異,結(jié)果見表1。其RSD<15%,符合檢測要求。

2.8方法學(xué)回收率在空白血漿中加入克林霉素儲備液,配制成高、中、低3個濃度點(0.5、2.0、16.0 g/ml)的質(zhì)控樣品,按2.3“血漿樣品處理”項下的方法處理,每個濃度平行分析6個樣本。以實際測得的峰面積與儲備液配制的相同濃度測得的峰面積的比計算回收率,結(jié)果見表1。

表1　血漿中鹽酸克林霉素HPLC測定方法的精密度與

2.9樣品穩(wěn)定性考察

2.9.1血樣保存穩(wěn)定性配制成高、中、低3個濃度點(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品,在-80 ℃冰箱貯存,分別于0、30、60及90 d檢測血藥濃度,結(jié)果表明,血樣中克林霉素含量變化RSD<15%。

2.9.2血樣放置穩(wěn)定性配制成高、中、低3個濃度點(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品,分別存放于-4 ℃和室溫條件,分別于0、2、4、6和8 h檢測血藥濃度,結(jié)果表明,血樣中克林霉素含量變化RSD<15%。

2.9.3血樣凍融穩(wěn)定性將高、中、低3個濃度點(0.5、2.0、16.0 g/ml)的血漿質(zhì)控樣品分別凍融6次(-80 ℃冷凍,室溫下融化)后檢測其濃度,含量變化RSD<15%,結(jié)果表明反復(fù)凍融對檢測結(jié)果無顯著影響。

2.10藥動學(xué)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),篩選20名健康志愿受試者口服鹽酸克林霉素膠囊300 mg,測定其主要藥動學(xué)參數(shù)為:平均t1/2為(2.26±0.55)h,平均Cmax為(3.24±1.26)μg/ml,平均達峰時間Tmax為(1.09±0.42)h,平均AUC(0-t)和AUC(0-∞)分別為(11.86±5.56)和(12.18±5.64)μg/(ml·h),平均血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖320名受試者單次口服克林霉素300 mg后平均血藥濃度-時間曲線

3討論

本研究從特異性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性及方法學(xué)回收率等方面進行了較為全面的方法學(xué)確證,所有檢測RSD均低于15%,符合人體血漿檢測方法學(xué)的要求[6]。將其用于人體藥代動力學(xué)研究,取得了較為理想的結(jié)果,所得到的藥代動力學(xué)參數(shù)與國內(nèi)外報道一致。研究中發(fā)現(xiàn),如果當(dāng)流動相pH值在6.5~6.8范圍內(nèi),克林霉素的出峰時間比較穩(wěn)定。

研究結(jié)果證實,本研究所建立的HPLC-UV法檢測人血漿中的克林霉素含量方法,專屬性、準(zhǔn)確性、靈敏度高,重現(xiàn)性好,樣品處理過程簡便,適合克林霉素臨床檢測需求。

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[6]《化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.《化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[M/OL].2005,國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心網(wǎng)站頒布,http://www.cde.org.cn/zdyz.do?method=largePage&id=2070

(收稿日期:2014-11-03)

文章編號1004-0188(2015)03-0299-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.026

中圖分類號R 927.11

文獻標(biāo)識碼A