作者單位:400038 重慶,第三軍醫(yī)大學流行病學教研室(梁　棟)；成都軍區(qū)疾病預防控制中心(梁　棟,石清明,張超雄,陳錨錨,鄧成玉,范泉水)；軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所(涂長春)

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尼帕病毒N基因的原核表達

作者單位:400038 重慶,第三軍醫(yī)大學流行病學教研室(梁棟)；成都軍區(qū)疾病預防控制中心(梁棟,石清明,張超雄,陳錨錨,鄧成玉,范泉水)；軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所(涂長春)

梁棟,涂長春,石清明,張超雄,陳錨錨,鄧成玉,范泉水

[摘要]目的利用尼帕病毒(NiV)的N基因進行原核表達,探討NiV N蛋白作為檢測NiV存在的抗原的可能性。方法利用pET-28a(+)作為表達載體,構建pET-NiV N重組質(zhì)粒,通過IPTG誘導使其表達蛋白,并用Western blot方法進行原核表達NiV N蛋白的檢測。結果通過PCR、酶切和連接反應,成功構建N蛋白的pET-NiV N重組質(zhì)粒,大小為1596 bp；利用IPTG誘導pET-NiV N重組質(zhì)粒在宿主菌中表達N蛋白,SDS-PAGE結果顯示,55 kD有特異蛋白條帶,與蛋白預計大小相符,經(jīng)Bandscan軟件掃描分析,重組蛋白量占菌體總蛋白量的12%；Western blot法檢測顯示,55 kD的條帶顯色良好,證明是本實驗所需要得到的目的蛋白。結論使用原核表達系統(tǒng)成功表達了NiV的N蛋白,為其進一步的抗體制備、活性鑒定及研究應用奠定了基礎。

[關鍵詞]尼帕病毒；N基因；原核表達

Prokaryotic expression of Nipah virus N gene

Liang Dong1,2, Tu Changchun3, Shi Qingming2, Zhang Chaoxiong2, Chen Maomao2, Deng Chengyu2, Fan Quanshui21. Research Room of Epidemiology, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China; 2. The Center for Disease Prevention and Control, Chengdu Military Command, Chengdu, Sichuan, 610021, China; 3. Military Veterinary Research Institute of Military Medical Science Academy of the PLA, Changchun, Jilin, 130000, China

[Abstract]ObjectiveTo explore the possibility of Nipah virus (NiV) N protein as an antigen to detect the presence of NiV by using the prokaryotic expression of NiV N gene.MethodspET-28a (+) was used as an expression vector in order to construct the recombinant plasmid of pET-NivN, which was induced by IPTG to express the protein; and then, Western blot method was used to detect the prokaryotic expression of NivN protein.ResultsBy means of PCR, enzyme digestion and ligation reaction, the recombinant plasmid of pET-NivN was constructed successfully, with a size of 1596 bp; IPTG was used to induce the recombinant plasmid of pET-NivN to express N protein in the host bacteria. SDS-PAGE results showed that 55 kD has a specific protein band with the expected protein size; according to the Bandscan software scanning and analysis, the amount of recombinant protein was 12% of the total bacteria protein. Western blot assay showed that the band of 55 kD has a good color, and this proved that it was just the protein to be obtained in the experiment.ConclusionThe prokaryotic expression system can express N protein of NiV successfully, and this lays solid foundation for further antibody preparation, activity evaluation, and research application.

[Key words]Nipah virus; N gene; prokaryotic expression

尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一種新發(fā)現(xiàn)的、人獸共患的副粘病毒,可導致人或動物的腦炎或呼吸道炎癥,其致死率很高。由于該種病毒的自然宿主為狐蝠科(Pteropid)的食果蝠蠅(fruit bat)[1],活動范圍較廣,NiV有可能在一定區(qū)域內(nèi)的食果蝙蝠中相互傳播,因此,相同種類蝙蝠分布的國家和地區(qū)會面臨病毒突變、疫病暴發(fā)流行的危險。近年來,NiV在周邊國家的流行態(tài)勢對我國造成了潛在威脅[2-8]。我國目前尚未檢出NiV,但是我國東南沿海地區(qū)和云南地區(qū)具有適合NiV流行的生態(tài)環(huán)境和宿主動物,且已發(fā)現(xiàn)NiV的自然宿主,因此,有必要開展針對NiV檢測手段的相關研究。NiV屬副粘病毒科成員,為不分節(jié)段的負鏈RNA病毒,其總基因組大小為18.2 kb,共有6個轉(zhuǎn)錄單位,編碼6個蛋白:磷酸化蛋白(P)、核衣殼蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)和糖蛋白(G),其基因組結構順序為3'-N-P-M-F-G-L-5'[9]。

NiV病毒N基因全長1596 bp,其編碼的N蛋白全長為532個氨基酸。N蛋白為NiV結構蛋白中含量最豐富的蛋白,其產(chǎn)生的抗體中和活性較差[10],但是N蛋白的免疫原性較強,能在早期刺激機體產(chǎn)生抗體,且抗體滴度高、持續(xù)時間長,因此,可以作為NiV的檢測抗原[11]。

本研究通過基因工程的方法,對NiV的N蛋白進行了原核表達,表達的蛋白可用于建立相應抗體檢測方法、開展野生動物的抗體監(jiān)測以及單克隆抗體的制備。且原核表達的蛋白成本低廉,適合后續(xù)研發(fā)相應的檢測試劑盒。

1材料與方法

1.1材料與設備NiV(澳大利亞動物健康實驗室)；含有NiV核蛋白基因(N)的質(zhì)粒pFBHa-NiVN由上海生工合成；表達載體PET-28a(+)購自Novagen；感受態(tài)細胞DH5α、BL21(DE3)購自Tiangen公司；T4DNA連接酶購自Promaga公司；ExTaq聚合酶、IPTG、各種核酸內(nèi)切酶、DL2000購自TaKaRa大連公司；DNA凝膠片段回收試劑盒購自Axygen公司。PCR細胞儀(CD3221)購自珠海歐雷電子科技有限公司。兔抗NiV全病毒血清,HRP標記的羊抗兔IgG和蛋白印跡Western blot檢測所需試劑由上海威奧生物有限公司提供。

1.2方法

1.2.1引物設計參照已經(jīng)發(fā)表的NiV株全序列[12],設計了一對引物(上游引物:NiVNFP；下游引物:NiVNRP),用于NiVN基因的PCR克隆,引物序列見表1。

表1　擴增NiVN基因的引物序列及酶切位點

1.2.2目的基因的PCR擴增和產(chǎn)物回收PCR反應采用25 μl反應體系(共10管,以供PCR產(chǎn)物回收),體系的組成為:10×buffer 2.5 μl,dNTP 2 μl,NiVNFP(10 pmol/μl)1 μl,NiVNRP(10 pmol/μl)1 μl,ExTaq DNA聚合酶1 μl,含有目的基因的質(zhì)粒1 μl,補加ddH2O至25 μl。PCR反應條件:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,35個循環(huán)；最后72 ℃ 5 min延伸后結束反應。取5 μl的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳,拍照后用DNA凝膠片段回收試劑盒進行回收。

1.2.3PCR回收產(chǎn)物和表達載體的雙酶切及產(chǎn)物回收將PCR回收產(chǎn)物進行雙酶切,反應體系如下:PCR回收產(chǎn)物10 μl,兩種核酸內(nèi)切酶各1 μl,緩沖液2.5 μl,最后補加ddH2O至25 μl,37 ℃水浴酶切1 h,65 ℃滅活15 min,置于-20 ℃超低溫冰箱凍存。將表達載體pET-28a(+)進行雙酶切,反應體系如下:pET-28a(+)10 μl,兩種核酸內(nèi)切酶各1 μl,緩沖液2.5 μl,最后補加ddH2O至25 μl,37 ℃水浴酶切1 h,65 ℃滅活15 min,電泳觀察酶切效果,將切開的載體用DNA凝膠片段回收試劑盒回收。

1.2.4構建重組質(zhì)粒取酶切好的目的基因片段和表達載體片段,進行連接反應,反應體系如下:目的基因DNA 7.5 μl,表達載體片段0.5 μl,10×T4DNA連接酶1 μl,T4DNA連接酶1 μl,最后補加ddH2O至10 μl,置于16 ℃水浴中過夜連接。

1.2.5誘導目的基因表達取構建好的重組表達質(zhì)粒PET-NN轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,將轉(zhuǎn)化子涂平板后接種LB培養(yǎng)基,方法同前。進行菌液PCR和PCR產(chǎn)物雙酶切鑒定,并將菌液送檢測序。將PCR陽性的菌落接種5 ml Kan+的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜后,重組菌加入70%的甘油進行保種,剩余的菌種按照0.1%的比例接種于50 ml的Kan+ LB培養(yǎng)基中,37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)至細菌濃度達到對數(shù)生長中期(OD600=0.6~1.0)時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導3 h后,取3 ml菌液離心后,去上清,加入1 ml PBS懸浮細菌,離心,去上清,再加入100 μl的SDS-PAGE上樣緩沖液,4 ℃裂解10 min,然后煮沸10 min,離心,取8 μl上清進行SDS-PAGE(濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%)。

1.2.6Western blot蛋白印跡檢測首先進行SDS-PAGE電泳,電泳完成后,小心將膠取出置于轉(zhuǎn)膜槽中,轉(zhuǎn)膜條件為15 V,電轉(zhuǎn)20 min后用脫脂牛奶封閉,37 ℃ 2 h。用1∶100稀釋的兔抗NiV全病毒血清共孵育2 h,用PBS洗滌3次；二抗為HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育30 min,用PBS洗滌3次后,將膜加入底物溶液,顯色完畢后拍照記錄。

2結果

2.1目的基因的PCR擴增目的基因PCR擴增后,取5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳,從圖1可以看到,PCR擴增產(chǎn)物條帶大小約為1596 bp,與預期結果相符。

2.2構建重組質(zhì)粒PCR擴增的目的基因與pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切后進行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后,挑取單克隆菌落進行PCR鑒定,得到陽性結果,見圖2；提取重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,雙酶切產(chǎn)物的大小和預期相符,見圖3。將PCR產(chǎn)物進行測序,結果與NiV N蛋白序列完全一致,命名為pET-NiVN。

2.3重組質(zhì)粒pET-NiVN的誘導表達pET-NiVN經(jīng)過IPTG誘導后,進行SDS-PAGE。從圖4可以看出,PET-NiVN在55 kD上面有特異性的蛋白條帶,與目的蛋白預計大小相符合。

2.4Western blot測定結果為確定本研究中原核表達系統(tǒng)是否成功表達了NiV的N蛋白,將兔抗NiV全病毒血清作為一抗進行定性檢驗。結果發(fā)現(xiàn)55 kD的條帶顯色良好(圖5)。

1:PCR擴增的目的基因產(chǎn)物(圖中劃圈處)；2:陰性對照；M:DNA Marker DL2000

圖2　重組質(zhì)粒PCR鑒定

M:DNA Marker DL2000；1:陰性對照；2:重組質(zhì)粒pET-NiVN的PCR擴增產(chǎn)物(圖中劃圈處)

圖3　重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

1:重組質(zhì)粒pET-NiVN雙酶切產(chǎn)物(圖中劃圈處a:PET-28a(+)載體；b:目的基因)；M:DNA Marker DL2000

圖4pET-NiVN經(jīng)過IPTG誘導后的SDS-PAGE

1:pET-28(a)+轉(zhuǎn)化BL21(DE3)誘導對照；M:蛋白Marker；2:pET-NiVN轉(zhuǎn)化BL21(DE3)誘導后產(chǎn)物(圖中劃圈處)

圖5Western blot測定結果

1:pET-28(a)+轉(zhuǎn)化BL21(DE3)誘導對照；M:蛋白Marker；2:目的蛋白(圖中劃圈處)

3討論

NiV是近年來新出現(xiàn)的副粘病毒,能感染多種動物,對人有較高的致死率,因而具有重要的公共衛(wèi)生學意義。如果直接對NiV的蛋白進行純化,有一定的危險性,同時純化成本高、風險大,也為法律所禁止。如果通過基因工程的方法表達N蛋白,不僅生物危險性低,且價格低廉。只要基因工程抗原具有足夠高的敏感性,那么利用重組蛋白座位檢測用抗原是完全可行的,同時也利于實驗的標準化。

本實驗將N基因與pET-28a(+)載體的His-Taq基因融合,對重組菌進行誘導表達和SDS-PAGE分析可以清楚看到相對于陰性對照,55 kD處有特異的N蛋白條帶,重組蛋白在菌體中主要是以包涵體的形式存在。本研究使用原核表達系統(tǒng)成功表達了NiV的N蛋白,且能在Western blot反應中與陽性血清反應,說明以原核表達的重組N蛋白座位檢測抗原是可行的,這為以后建立針對NiV的血清抗體檢測的ELISA方法打下了基礎。

當然,原核表達出來的N蛋白與NiV的N蛋

白還是存在一定的差異性,這些差異性是否會導致檢測方法的假陽性或假陰性,還需要進一步驗證。希望在將來的實驗中,將表達出來的N蛋白免疫動物,得到抗N蛋白血清,為研制尼帕病毒早期檢測試劑奠定研究基礎。

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(收稿日期:2014-10-24)

文章編號1004-0188(2015)03-0255-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.009

中圖分類號R 373

文獻標識碼A

通訊作者:范泉水,E-mail:fqs168@126.com