吳先闖， 郝海軍， 張永州， 宋曉勇* ， 劉瑜新， 張紅芹

(1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南 開封475000;2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200437;3. 國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心，上海201203)

姜黃素(curcumin)是中藥姜黃的主要成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗病毒及抗腫瘤等多種藥理活性［1-3］。但是，姜黃素水溶性差，半衰期短，生物利用度很低，極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。磷脂復(fù)合物(phospholipid complex or phytosomes)是藥物和磷脂通過(guò)氫鍵、分子間作用力等方式形成的非共價(jià)結(jié)合物，在改善中藥有效成分的理化性質(zhì)方面有著廣泛應(yīng)用［4-6］，它既可增強(qiáng)水溶性藥物的脂溶性，也可增強(qiáng)脂溶性藥物的水溶性，從而提高藥物在胃腸道中的吸收、生物利用度和療效。但是，很多研究表明［6］，藥物和磷脂之間的結(jié)合力很弱，容易受到胃腸液、pH、酶等因素的影響而解離出原形藥物，從而失去增加溶解度或吸收的作用，因此磷脂復(fù)合物不同給藥形式對(duì)藥物的生物利用度有較大的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較姜黃素磷脂復(fù)合物水分散體、固體分散體及油制劑對(duì)生物利用度的影響，篩選出理想的給藥形式，為開發(fā)姜黃素磷脂復(fù)合物或其他藥物-磷脂復(fù)合物的口服制劑提供有價(jià)值的參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 姜黃素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110752-201005);姜黃素原料藥(西安榮升生物技術(shù)有限公司，批號(hào)100624);大黃素對(duì)照品 (天津科曼思特有限公司，批號(hào)20120301);大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司);姜黃素磷脂復(fù)合物(自制，批號(hào)20140928);聚乙烯吡咯烷酮、司盤-80、冰醋酸、羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);中鏈甘油三酸酯(馬來(lái)西亞吉隆坡甲洞集團(tuán));其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 U3000 型HPLC 色譜儀(美國(guó)戴安公司);BP-210D 型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);RE-5298A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);DZF 型真空干燥箱(北京中科環(huán)試儀器有限公司);KL512 型氮吹儀(北京康林科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠24 只，雌雄各半，體質(zhì)量(300 ±20)g (上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK ［滬］2003-0003)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素磷脂復(fù)合物的制備［7］取姜黃素和大豆磷脂(摩爾比1 ∶1)置于圓底燒瓶中，加入適量四氫呋喃，55 ℃下避光攪拌4 h，減壓旋蒸除去四氫呋喃，再加入適量正己烷，攪拌10 min，過(guò)濾，減壓旋蒸除去溶劑。然后，將其溶于無(wú)水乙醚中，過(guò)濾除去未參加反應(yīng)的姜黃素，減壓旋蒸除去無(wú)水乙醚，40 ℃真空干燥箱放置24 h，即得，再充入氮?dú)?，密封保存?/p>

2.2 姜黃素磷脂復(fù)合物固體分散體的制備［8］取姜黃素磷脂復(fù)合物與PVP K30 適量 (質(zhì)量比為1 ∶5)，加入無(wú)水乙醇，攪拌3 h，減壓旋蒸除去溶劑，55 ℃下真空干燥12 h，即得，再充入氮?dú)?，密封保存?/p>

2.3 灌胃供試液的配制

2.3.1 姜黃素、磷脂復(fù)合物、固體分散體混懸液的制備 取姜黃素、磷脂復(fù)合物及固體分散體適量，置于含0.5%CMC-Na 的蒸餾水中，超聲分散，配制成60 mg/mL (以姜黃素計(jì))的混懸液，即得。

2.3.2 姜黃素磷脂復(fù)合物油制劑的制備 取磷脂復(fù)合物適量，加入少量司盤-80，研磨后溶解于中鏈甘油三酯中，制成60 mg/mL (以姜黃素計(jì))的油制劑，即得。

2.4 分組、給藥與血樣采集 將24 只SD 大鼠隨機(jī)分為4 組，每組6 只，禁食不禁水。12 h 后，按1 g/kg 給藥量(以姜黃素計(jì))分別灌胃給予姜黃素、磷脂復(fù)合物水分散體、固體分散體和油溶液。接著，于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行眼眶取血(約0.5 mL)，離心3 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)，小心分取上層血漿，置于離心管中，-20 ℃冰箱保存。

2.5 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取姜黃素15.84 mg，置于250 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為63.36 μg/mL 的姜黃素對(duì)照品溶液;精密稱取大黃素5.00 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，精密量取1.0 mL，甲醇定容至10 mL，再精密量取2.5 mL，甲醇定容至10 mL，即得大黃素對(duì)照品溶液。

2.6 血漿樣品的處理［9-10］取血漿樣品200 μL，置于離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)大黃素溶液 (5 μg/mL)25 μL，再加入醋酸乙酯500 μL，渦旋混合3 min，離心10 min (轉(zhuǎn)速10 000 r/min)。然后，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一離心管中，氮?dú)獯蹈桑?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混合3 min，離心10 min (轉(zhuǎn)速10 000 r/min)，進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行測(cè)定。

2.7 大鼠血漿中姜黃素的測(cè)定

2.7.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為乙腈-2%醋酸水溶液(55 ∶45);檢測(cè)波長(zhǎng)420 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

2.7.2 方法學(xué)考察［9-10］

2.7.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取姜黃素對(duì)照品貯備液0.05、0.1、1、2、4 mL，置于10 mL 量 瓶 中，得 到0.316 8、0.633 6、6.336、12.672、25.344 μg/mL 一系列質(zhì)量濃度，然后分別精密吸取姜黃素對(duì)照品溶液25 μL，置于2 mL離心管中，氮?dú)獯蹈?，再加入空白血漿200 μL，渦旋混合3 min，得到質(zhì)量濃度分別為0.039 6、0.079 2、0.792、1.584、3.168 μg/mL 的姜黃素血漿溶液，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。以姜黃素和大黃素的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，血漿中姜黃素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，血漿樣品中姜黃素的質(zhì)量濃度在0.039 6 ～3.168 μg/mL時(shí)，姜黃素和大黃素的峰面積之比與姜黃素的質(zhì)量濃度之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.099 0 C+0.051 1 (r=0.999 4)。

2.7.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 分別取質(zhì)量濃度為0.039 6、0.792、3.168 μg/mL 的姜黃素血漿溶液適量，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果，日內(nèi)精密度RSD 分別為5.19%、3.82% 和3.14%，而日間精密度(連 續(xù) 3 d)RSD 分 別 為 7.42%、5.29% 和4.99%。再取以上3 個(gè)質(zhì)量濃度的姜黃素血漿溶液200 μL (每個(gè)質(zhì)量濃度3 份)，氮?dú)獯蹈桑謩e加入質(zhì)量濃度為4.95 μg/mL 的姜黃素對(duì)照品300 μL，渦旋混合3 min，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加入量和回收量。結(jié)果，3 個(gè)質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為95.47%、96.82%、106.95%，RSD 分別為7.41%、9.58%、8.88%。再取以上3 個(gè)質(zhì)量濃度的姜黃素血漿溶液各3 份，分別冰凍/解凍3次，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果，3 個(gè)質(zhì)量濃度的RSD 分別為5.66%、7.17%、6.09%，表明反復(fù)凍融對(duì)血漿樣品的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.8 不同給藥形式的大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 姜黃素磷脂復(fù)合物按不同給藥形式，分別給大鼠灌胃，按“2.6”項(xiàng)下方法處理，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，并繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 姜黃素和姜黃素磷脂復(fù)合物不同給藥形式血藥濃度-時(shí)間曲線(±s，n=6)Fig.1 Concentration-time curves of curcumin and different administration of curcumin-phospholipid complex (±s，n=6)

主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用3P97 程序統(tǒng)計(jì)矩模型進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)以“±s”的形式表示，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，姜黃素磷脂復(fù)合物的各給藥形式均可提高姜黃素的口服吸收生物利用度，其水分散體與固體分散體的AUC0-∞與原料藥相比，具有顯著性差異，但這兩種分散體之間無(wú)顯著性差異。另外，將姜黃素磷脂復(fù)合物以油制劑形式給藥時(shí)，與原料藥的AUC0-∞相比，差異非常顯著，而且與水或固體分散體的AUC0-∞相比，也有顯著性差異，并且其t1/2與tmax均有所延長(zhǎng)。

表1 姜黃素和姜黃素磷脂復(fù)合物不同給藥形式的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of curcumin and different administration of curcumin -phospholipid complex (±s，n=6)

表1 姜黃素和姜黃素磷脂復(fù)合物不同給藥形式的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of curcumin and different administration of curcumin -phospholipid complex (±s，n=6)

注:與姜黃素比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與姜黃素磷脂復(fù)合物或磷脂復(fù)合物固體分散體比較，△P ＜0.05

參數(shù) 單位 姜黃素 姜黃素磷脂復(fù)合物 磷脂復(fù)合物固體分散體 磷脂復(fù)合物油制劑tmax h 0.68 ±0.10 1.17 ±0.23 1.19 ±0.22 1.89 ±0.29*Cmax μg·mL -1 0.76 ±0.12 1.02 ±0.18* 1.26 ±0.19* 1.84 ±0.23*t1/2 h 1.51 ±0.16 2.12 ±0.19 2.49 ±0.22 3.39 ±0.25*AUC0-t μg·h·mL -1 1.39 ±0.18 5.73 ±0.92＊＊ 6.00 ±1.26＊＊ 10.28 ±2.32＊＊△AUC0-∞ μg·h·mL -1 1.62 ±0.23 8.19 ±2.00＊＊ 8.87 ±2.21＊＊ 12.94 ±3.11＊＊△

3 討論

影響口服制劑生物利用度的關(guān)鍵因素是溶解性質(zhì)及溶出速率。藥物制備成磷脂復(fù)合物后，溶解性質(zhì)得到改善，有利于藥物順利通過(guò)胃腸道黏膜，增加進(jìn)入血液循環(huán)的量，但它并未改善難溶性藥物的疏水性，因此其溶出速率較慢，而固體分散體可提高藥物的溶出速率及溶出度，有利于提高其生物利用度。將姜黃素磷脂復(fù)合物制備成固體分散體后，雖然可改善藥物從磷脂復(fù)合物中的溶出速率及溶出度，但其生物利用度與磷脂復(fù)合物相比，并未得到明顯提高。研究表明［11］，當(dāng)藥物形成磷脂復(fù)合物后，它與磷脂的分子間作用力并不是很緊密，在水相或其他因素作用下，磷脂復(fù)合物在水中將重新解離成藥物活性分子和磷脂分子，因而失去了增加藥物溶解度、促進(jìn)藥物吸收的作用。因此，固體分散體技術(shù)與磷脂復(fù)合物聯(lián)用時(shí)，未必能進(jìn)一步提高藥物的生物利用度。

磷脂復(fù)合物常采用新技術(shù)被制備成納米粒、微乳、亞微乳、膠束等，但在制備過(guò)程中，磷脂復(fù)合物難免與水相接觸，容易導(dǎo)致它在給藥之前就發(fā)生解離［12］，而且被制備成不同形式后，制劑的穩(wěn)定性［6，13-14］及載藥量［15］也存在較大的問(wèn)題。但是，它以油制劑形式給藥時(shí)，可降低因胃腸道各因素的干擾而發(fā)生解離的幾率，而且油性基質(zhì)本身或其水解產(chǎn)物也可促進(jìn)藥物的吸收，另外由于磷脂復(fù)合物在油制劑中的溶解度較好，因此載藥量較高。從藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果來(lái)看，姜黃素磷脂復(fù)合物以油制劑形式給藥時(shí)，其AUC0-∞與原料藥相比，有非常顯著地提高(7.99 倍);與磷脂復(fù)合物水或固體分散體相比，也有顯著性提高(分別為1.58 或1.46 倍)，而且Cmax延長(zhǎng)至 (1.89 ± 0.29)h;t1/2延長(zhǎng)至(3.39 ±0.25)h，表現(xiàn)出一定緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)表明，油制劑在磷脂復(fù)合物給藥系統(tǒng)中具有較大的優(yōu)勢(shì)，而且其制備過(guò)程較為簡(jiǎn)單，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，推動(dòng)我國(guó)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程。但是，磷脂復(fù)合物油制劑在體內(nèi)的吸收機(jī)理、不同油基質(zhì)對(duì)磷脂復(fù)合物生物利用度和穩(wěn)定性的影響等問(wèn)題仍有待于作進(jìn)一步研究。

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