李洪澤 齊驍勇 韓風(fēng)雨 孔新穎 劉福青

實驗研究

HPLC法測定六味首烏顆粒中二苯乙烯苷的含量

李洪澤 齊驍勇 韓風(fēng)雨 孔新穎 劉福青

目的建立高效液相色譜法(HPLC)測定六味首烏顆粒中二苯乙烯苷含量的方法。方法采用高效液相色譜法, 色譜柱為Luna5 μm, C18(2),250 mm×4.60 mm100 A。流動相為甲醇-0.2％磷酸溶液(29∶71), 流速為1.0 ml/min, 檢測波長為320 nm。結(jié)果二苯乙烯苷濃度在4.99～29.94 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, r=0.9999；二苯乙烯苷平均回收率為98.42％, RSD為1.04％。結(jié)論高效液相色譜法測定方法操作簡便、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好, 可用于六味首烏顆粒的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；六味首烏顆粒;二苯乙烯苷;含量測定

本方由制何首烏、淫羊藿、菟絲子、虎杖、川芎、白芍6味中藥組成, 制何首烏為方中君藥, 具有補肝腎, 益精血,烏須發(fā), 強筋骨的作用。所含主要有效成分為2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(以下簡稱：二苯乙烯苷), 該化合物具有廣泛的心血管活性, 免疫調(diào)節(jié), 保肝作用等, 因而常作為何首烏質(zhì)控指標成分。故選擇二苯乙烯苷作為定量分析成分, 以保證制劑的質(zhì)量。通過試驗及參考有關(guān)研究文獻, 建立了高效液相法, 測定本制劑中二苯乙烯苷的含量。

1 材料與方法

1.1 材料 惠譜1100-型高效液相色譜儀；紫外Model500檢測器；色譜柱為色譜柱 ：Luna5 μm, C18(2),250×4.60 mm100 A；AB135-S電子天平 ；Model C3860A超聲波儀(上海超聲儀器廠)。

六味首烏顆粒(批號：20050511, 內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司)；二苯乙烯苷標準物質(zhì)(含量測定用批號：110844-200404, 中國食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純,磷酸為分析純, 純凈水(娃哈哈)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.2％磷酸溶液(29∶71)為流動相；檢測波長為320 nm。理論板數(shù)按2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于3000。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量, 加50％甲醇溶解制成每1 ml含20 μg的溶液, 即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量, 研細, 取約0.3 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入50％甲醇50 ml,密塞, 稱定重量, 超聲處理(功率300 W, 頻率40 kHz)30 min,放冷, 再稱定重量, 用甲醇補足減失的重量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得。

1.2.4 陰性溶液的制備 取除制何首烏外的其他藥材, 制成樣品, 參照供試品溶液的制備方法, 制得陰性溶液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取二苯乙烯苷對照品溶液(0.0998 mg/ml) 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 ml, 置10 ml量瓶中, 加50％甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 分別精密吸取各對照品溶液各20 μl, 注入液相色譜儀, 測定峰面積。以進樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標, 繪制標準曲線, 其回歸方程為：Y=69.89779.9199, r=0.9999。結(jié)果表明, 二苯乙烯苷濃度在4.99～29.94 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系, 見表1。

表1 線性關(guān)系進樣量與峰面積表(μg/ml)

2.2 提取溶媒選擇 取供試品數(shù)份, 精密稱定, 分別加入甲醇、乙醇、50％甲醇、50％乙醇, 超聲處理30 min, 按高效液相色譜法測定。結(jié)果表明, 采用上述四種溶劑提取, 但以50％甲醇提取含量最高, 測得的峰形良好, 分離度良好, 干擾峰較小, 故選擇50％甲醇作為提取溶媒, 見表2。

表2 不同溶媒提取比較結(jié)果(mg/g)

2.3 提取方法及提取時間選擇 取供試品數(shù)份, 加入50％甲醇, 分別采用超聲處理與加熱回流30 min方式提取, 按高效液相色譜法測定。結(jié)果表明, 兩種提取方法的提取效率相差不大, 為方便起見, 采用超聲提取。分別采用不同提取時間及不同超聲功率進行考察, 見表3, 表4。

表3 不同提取方式含量數(shù)據(jù)表(mg/g)

表4 超聲提取條件含量數(shù)據(jù)表(mg/g)

2.4 陰性對照試驗 取對照品溶液、陰性溶液及供試品溶液, 注入色譜儀測定。結(jié)果表明, 陰性溶液與對照品色譜相同保留時間處無色譜峰, 供試品在對應(yīng)位置色譜峰與相臨峰分離度符合要求, 峰形好, 故陰性無干擾。

2.5 精密度試驗 精密稱取供試品適量, 按“供試品溶液的制備”項下方法制備, 重復(fù)進樣5次, 測定峰面積, 見表5, RSD％為0.40％, 可見儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取供試品, 按“供試品溶液的制備”項下制備, 分別于第0、4、8、12、16、20小時進樣測定,結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)基本穩(wěn)定, 見表6。

表5 精密度試驗結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱供試品, 按“供試品溶液的制備”項下制備, 依法測定, 結(jié)果其含量平均值為4.83 mg/g, RSD=1.6％, 表明此方法重復(fù)性良好, 見表7。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品(批號：20050511)約0.1 g, 分別精密加入二苯乙烯苷對照品溶液(0.486 mg/ml)1.0 ml, 按“供試品溶液的制備”方法制備, 依法測定, 按下式計算回收率, 見表8。

表7 重復(fù)性試驗(mg/g, ％)

表8 二苯乙烯苷回收率測定結(jié)果(mg, ％)

3 樣品測定

取三批中試樣品, 按含量測定方法, 依法測定, 見表9。

根據(jù)以上測定結(jié)果, 暫定本品每袋含二苯乙烯苷(C20H22O9)應(yīng)不得少于12.5 mg。

表9 樣品測定結(jié)果(mg/袋)

4 討論

4.1 樣品提取條件的選擇在研究過程中分別進行了不同溶劑(甲醇、50％甲醇、50％乙醇)、不同提取方法(超聲處理、回流提取)和不同提取時間(20、30、40 min)的比較, 最后確定以50％甲醇超聲處理30 min為最佳。

4.2 本試驗的二苯乙烯苷含量測定的色譜條件, 能使二苯乙烯苷與其他組分達到較好的分離, 線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率數(shù)據(jù)均符合定量要求, 可作為六味首烏顆粒質(zhì)量標準中二苯乙烯苷含量測定的測定方法。

綜上所述, 該測定方法操作簡便、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好,可用于六味首烏顆粒的質(zhì)量控制。

Content determination of stilbeneglycoside in Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules by HPLC

LI Hong-ze, QI Xiao-yong, HAN Feng-yu, et al. Inner Mongolia Tianqi Zhongmeng Pharmaceutical Limited Liability Company, Chifeng 024000, China

ObjectiveTo establish a method for content determination of stilbeneglycoside in Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules by high performance liquid chromatography (HPLC).MethodsHPLD was applied by chromatographic column as Luna5 μm, C18(2),250 mm×4.60 mm100 A. The mobile phase was methyl alcohol -0.2％ phosphoric acid solution (29:71) with1.0 ml/min of flow rate and320 nm of detection wavelength.ResultsThe concentration of stilbeneglycoside showed a good linear correlation in the range of4.99～29.94 μg/ml, r=0.9999. The average recovery rate of stilbeneglycoside was98.42％, RSD=1.04％.ConclusionHPLC has the advantages of easy operation, precise effect, and good reproducibility. It can be applied for quality control of Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules.

High performance liquid chromatography; Liuwei Polygonum multiflorum Thunb granules; Stilbeneglycoside; Content determination

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.02.159

2014-10-09］

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