戴宇翔　王審　李晨光　黃浙勇　陸浩　常書福　錢菊英　葛雷　王齊兵

顏彥1　樊冰1　張峰1　姚康1　馬劍英1　黃東1　葛均波1

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上?！?00032；2. 浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江溫嶺　317500)

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·論著·

梗死心肌側(cè)枝血管形成與缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子A表達(dá)水平的關(guān)系及臨床意義

戴宇翔1王審2李晨光1黃浙勇1陸浩1常書福1錢菊英1葛雷1王齊兵1

顏彥1樊冰1張峰1姚康1馬劍英1黃東1葛均波1

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海200032；2. 浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江溫嶺317500)

摘要目的：探討冠狀動脈慢性完全閉塞(chronic total occlusion，CTO)后梗死心肌中側(cè)枝血管形成與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)表達(dá)水平的關(guān)系及其臨床意義。方法： 連續(xù)收集經(jīng)冠狀動脈造影明確為完全閉塞病變者214例，結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及(或)影像學(xué)資料，確診為CTO者89例。采用ELISA法檢測HIF-1α和VEGF-A的蛋白水平；提取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用定量PCR法測定PBMC中VEGF-A 的mRNA水平。采用JMP 9.0和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果：比較各組糖尿病患者比例，Rentrop 2級組(11/31，35.5%)和3級組(3/20，15.0%)顯著低于0~1級組(18/38，47.4%)，P<0.05；比較各組的空腹血糖水平，Rentrop 2級組(6.67±1.41) mmol/L)和3級組(5.48±1.26)mmol/L)顯著低于0~1級組(7.24±1.39)mmol/L)，P<0.05；比較各組患者中臨床心衰(NYHA Ⅱ~Ⅳ級)的比例，Rentrop 2級組(12/31，38.7%)和3級組(3/20，15.0%)顯著低于0~1級組(20/38，52.6%)，P<0.05；比較各組HIF-1α和VEGF-A的蛋白水平，Rentrop 2級組[(85.5±27.7) pg/mL，(139.5±42.1) pg/mL]和3級組[(103.3±30.2) pg/mL，(162.6±43.3) pg/mL]顯著高于0~1級組[(42.0±16.1)pg/mL，(76.5±32.2) pg/mL]，P均<0.01；比較各組HIF-1α和VEGF-A的mRNA水平,Rentrop 2級組(1.31±0.46)和3級組(1.38±0.44)VEGF-A的 mRNA相對表達(dá)水平顯著高于0~1級組(1.00±0.28)，P<0.01。結(jié)論：慢性持續(xù)缺血、缺氧所導(dǎo)致的HIF-1α和VEGF表達(dá)增加在促進(jìn)冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的建立、增加心肌血供、改善預(yù)后、減少臨床心功能不全的發(fā)生率方面具有重要意義。

關(guān)鍵詞冠狀動脈慢性完全閉塞；冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子A

近十幾年來，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的治療取得了長足發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)、冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)等已成為臨床上成熟的治療手段。然而，很多急性心肌梗死患者以及存在復(fù)雜病變(包括彌漫性小血管病變、慢性完全性堵塞病變、冠心病多支血管病變、多次介入治療或手術(shù)后血管閉塞等)的冠心病患者經(jīng)治療后仍不能實(shí)現(xiàn)完全的血運(yùn)重建。對這類患者而言，建立有效供血的側(cè)枝循環(huán)十分重要，有助于恢復(fù)缺血心肌的血供、挽救瀕死心肌、改善患者的癥狀和預(yù)后。新生血管生成則是建立有效側(cè)枝循環(huán)的第一步[1-3]。

血管的生成十分復(fù)雜，涉及多種基因的表達(dá)在空間和時間上的嚴(yán)密調(diào)控[4]。目前，關(guān)于缺血心肌的側(cè)枝循環(huán)形成過程中新生血管形成的機(jī)制尚不明了。在已發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，它可能在多種血管生成因子中起中心調(diào)控作用[5-6]。研究[7-8]表明，血管中VEGF基因的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)調(diào)控。本研究探討冠狀動脈慢性完全閉塞(chronic total occlusion，CTO)患者中冠狀動脈側(cè)枝血管的形成與VEGF及HIF-1α表達(dá)水平的關(guān)系及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料連續(xù)收集2014年9月—2014年12月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院經(jīng)冠狀動脈造影明確為完全閉塞病變的患者214例。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及(或)相應(yīng)影像學(xué)資料，214例中89例確診為CTO。入選標(biāo)準(zhǔn)：既往有心絞痛癥狀或核素掃描、運(yùn)動試驗(yàn)、動態(tài)心電圖等證實(shí)存在心肌缺血的客觀證據(jù)，選擇性冠狀動脈造影顯示冠狀動脈血管100%閉塞，遠(yuǎn)端血流心肌梗死溶栓試驗(yàn)(thrombolysis in myocardial infarction，TIMI)0級，閉塞血管直徑≥2.5 mm，閉塞時間≥3個月。本研究中的患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集、記錄臨床資料收集并記錄患者的一般資料、冠心病危險(xiǎn)因素(高血壓病史、高膽固醇病史、糖尿病病史、目前吸煙狀態(tài)等)和心功能指標(biāo)[左室射血分?jǐn)?shù)、紐約心臟協(xié)會(New York Heart Association,NYHA)分級情況等、氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)]；在患者入院后立即測量糖代謝指標(biāo)(空腹血糖等)、脂代謝指標(biāo)(總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等)并記錄結(jié)果。

1.2.2冠狀動脈造影(coronary arteriography，CAG)應(yīng)用德國Siemens公司 Axiom-Artis DTA平板數(shù)字減影血管造影系統(tǒng)和美國GE公司 Innova 2000全數(shù)字血管造影系統(tǒng)，從股動脈或橈動脈采用Judkins法行選擇性冠狀動脈造影，采用GE centricity AI 1000-GE Mnet軟件 (Version 4.2.7.05)分析CAG圖像。

1.2.3側(cè)枝循環(huán)的判定由兩位?？漆t(yī)師閱讀冠狀動脈造影資料。觀察側(cè)枝循環(huán)的來源、走行及閉塞血管遠(yuǎn)端的充盈情況。采用Rentrop法對側(cè)枝循環(huán)進(jìn)行評分：0 級側(cè)枝血管即病變遠(yuǎn)端無造影劑顯影；Ⅰ級為病變遠(yuǎn)端僅有輕微的造影劑顯影或小段的血管；Ⅱ級為病變遠(yuǎn)端可見長段血管顯影，但顯影較正常血管淺淡和緩慢；Ⅲ級為病變遠(yuǎn)端全部血管均顯影，且造影劑濃度與正常血管一致。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定血HIF-1α和VEGF-A水平取2 mL全血至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4℃以1500 r/min的速度離心 10 min，收集血細(xì)胞；裂解血細(xì)胞，提取總蛋白并定量；應(yīng)用美國Thermo Scientific公司的Human HIF-1αELISA Kit檢測HIF-1α蛋白水平，按照試劑盒的說明操作。取2 mL全血至EDTA抗凝管中，靜置 1 h，于4℃以1500 r/min的速度離心10 min，取上清； 應(yīng)用美國Invitrogen公司的Human VEGF-A ELISA Kit 檢測血清中的VEGF-A，按說明書操作。

1.2.5定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中VEGF-A mRNA水平取10mL全血至EDTA抗凝管中，采用Ficoll分層液密度梯度離心法提取PBMC后，用Trizol(美國Invitrogen公司)抽取總RNA。取1 μg總RNA，用Prime Script反轉(zhuǎn)錄酶[寶生物工程(大連)有限公司]和隨機(jī)引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR擴(kuò)增儀選用羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司的Light Cycler，試劑為SYBR Premix Ex Taq [寶生物工程(大連)有限公司]。PCR程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)。通過2ΔΔCt法對VEGF-A的mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對定量，內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。VEGF-A和GAPDH的引物見表1。

表1　PCR引物序列

2結(jié)果

2.1各組患者的臨床資料比較CTO病變側(cè)枝循環(huán)評分中Rentrop 0～1級組、2級組和3級組患者的臨床資料見表2。其中，Rentrop 2級組(11/31，35.5%)和3級組(3/20，15.0%)中糖尿病患者比例顯著低于0～1級組(18/38，47.4%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Rentrop 2級組[(6.67±1.41)mmol/L]和3級組[(5.48±1.26)mmol/L]的空腹血糖水平顯著低于0～1級組[(7.24±1.39)mmol/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；Rentrop 2級組(12/31，38.7%)和3級組(3/20，15.0%)的臨床心衰(NYHAⅡ～Ⅳ級)比例顯著低于0～1級組(20/38，52.6%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　各組患者的一般資料比較　(n, %)

注：LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；NYHA：紐約心功能分級；T-CHO：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白；NT-proBNP：氨基末端腦鈉肽前體

2.2各組患者血液中的HIF-1α和VEGF-A水平比較ELISA法檢測CTO病變側(cè)枝循環(huán)評分中Rentrop 0～1級組、2級組和3級組患者的血液HIF-1α和VEGF-A水平。結(jié)果顯示，Rentrop 2級組[(85.5±27.7)pg/mL和(139.5±42.1)pg/mL]、3級組[(103.3±30.2)pg/mL和(162.6±43.3)pg/mL]的HIF-1α和VEGF-A水平均明顯高于0～1級組[(42.0±16.1)pg/mL和(76.5±32.2)pg/mL]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。

圖1　ELISA法檢測不同側(cè)枝循環(huán)組患者的HIF-1α(A)和VEGF-A(B)水平

2.3各組患者PBMC中的VEGF-A mRNA表達(dá)水平比較定量PCR法檢測CTO病變側(cè)枝循環(huán)評分中Rentrop 0～1級組、2級組和3級組患者PBMC中的VEGF-A mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Rentrop 2級組(1.31±0.46)和3級組(1.38±0.44)的VEGF-A mRNA相對表達(dá)水平均明顯高于0～1級組(1.00±0.28)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

圖2　定量PCR法檢測PBMC中VEGF-A mRNA的相對表達(dá)水平

3討論

冠狀動脈完全閉塞導(dǎo)致心肌組織發(fā)生缺血、缺氧時，組織細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，這些因子參與損傷后的炎性反應(yīng)和組織修復(fù)[1-2,8-9]。VEGF是近年來已得到公認(rèn)的重要的促血管生長因子，其直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，是心肌正常生理狀態(tài)以及病理狀態(tài)下新生血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。HIF-1α是一種由缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA結(jié)合蛋白。缺氧情況下誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加是機(jī)體的一種適應(yīng)性反應(yīng)[8,10-11]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因，HIF-1α是VEGF轉(zhuǎn)錄的活化因子[7-8, 11-12]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血、缺氧時VEGF水平升高，刺激冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞激活、分裂和增殖，在心臟尤其是缺血心肌處冠狀動脈的原有側(cè)枝循環(huán)增加并有新生毛細(xì)血管形成[5-6]；而當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時，VEGF表達(dá)水平隨著HIF-1α表達(dá)量的增加而升高[7-8,11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈慢性完全閉塞所導(dǎo)致的心肌局部持續(xù)缺血、缺氧情況下，側(cè)枝循環(huán)形成良好組(Rentrop 2級和3級)的HIF-1α和VEGF-A水平均顯著高于無良好側(cè)枝循環(huán)組(Rentrop 0～1級)。HIF-1α和VEGF表達(dá)的一致性提示，CTO患者心肌缺血、缺氧時VEGF水平的升高可能是通過缺氧時HIF-1α的表達(dá)增加介導(dǎo)的。既往研究表明，HIF-1α在調(diào)節(jié)VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著中樞紐帶作用，它不僅提高了VEGF的轉(zhuǎn)錄活性，而且可增強(qiáng)VEGF mRNA的穩(wěn)定性[7, 11]，這可能是本研究中側(cè)枝循環(huán)形成良好組中VEGF mRNA水平升高的另一個原因。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在臨床表現(xiàn)上，側(cè)枝循環(huán)形成良好組(Rentrop 2級和3級)中糖尿病患者比例及空腹血糖水平都顯著低于無良好側(cè)枝循環(huán)組(Rentrop 0～1級)，提示糖尿病不利于冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的形成。這一研究結(jié)果與既往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致，可能與糖尿病導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙有關(guān)[13-14]。而側(cè)枝循環(huán)形成良好組患者的臨床心功能不全發(fā)生率顯著低于無良好側(cè)枝循環(huán)組，提示側(cè)枝循環(huán)形成可以使機(jī)體對心肌缺血產(chǎn)生代償性適應(yīng)，有效抑制心肌缺血，減少心肌重塑，從而降低心衰發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。

綜上所述，增加VEGF表達(dá)可促進(jìn)冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)建立，使機(jī)體對心肌缺血產(chǎn)生代償性適應(yīng)，減少心肌缺血，增加心肌血供，減少惡性心血管事件的發(fā)生。同時，VEGF表達(dá)升高所導(dǎo)致的新生血管形成有利于內(nèi)皮祖細(xì)胞的存活、歸巢、定向分化及心肌修復(fù)。因而，HIF-1α介導(dǎo)的VEGF表達(dá)有可能成為治療嚴(yán)重心肌缺血的一個新的方向。

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Relationship between Myocardial Collateral Vessel Formation and the Levels of Hypoxia-Inducible Factor 1-alpha and Vascular Endothelial Growth Factor A and Its Clinical Significance

DAIYuxiang1WANGShen2LIChenguang1HUANGZheyong1LUHao1CHANGShufu1QIANJuying1GELei1WANGQibing1YANYan1FANBing1ZHANGFeng1YAOKang1MAJianying1HUANGDong1GEJunbo11.DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032，China; 2:DepartmentofCardiology,TheFirstPeople’sHospitalofWenling,Wenling317500,China

AbstractObjective：The goal of this study was to analyze the clinical significance of relationship between myocardial collateral and the levels of hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) in patients with coronary chronic total occlusion lesion. Methods:89 patients with coronary chronic total occlusion lesion confirmed by clinical data and coronary angiography were identified. The levels of HIF-1α and VEGF-A were measured by ELISA, and the relative expression of VEGF-A of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) were measured by real-time PCR. The results were statistically analyzed by the statistical programme for social sciences (SPSS version 18.0) and software SAS JMP 9.0. Results: Compared to Rentrop 0-1 grade group (18/38，47.4%), Rentrop 2 (11/31，35.5%) and Rentrop 3 (3/20，15.0%) grade group had fewer diabetes mellitus. Rentrop 2 [(6.67±1.41) mmol/L] and Rentrop 3 [(5.48±1.26) mmol/L] grade group had lower fasting blood glucose than Rentrop 0-1 grade group [(7.24±1.39) mmol/L]. Rentrop 2 (12/31，38.7%) and Rentrop 3 (3/20，15.0%) grade group had fewer clinical heart failure (NYHA Ⅱ~Ⅳ grade) than Rentrop 0-1 grade group (20/38，52.6%). Rentrop 2 [(85.5±27.7) pg/mL，(139.5±42.1) pg/mL] and Rentrop 3 [(103.3±30.2) pg/mL，(162.6±43.3) pg/mL] grade group had higher levels of HIF-1α and VEGF-A than Rentrop 0-1 grade group [(42.0±16.1) pg/mL，(76.5±32.2) pg/mL]. Rentrop 2 (1.31±0.46) and Rentrop 3 (1.38±0.44) grade group had higher level of relative expression of VEGF-A in PBMC than Rentrop 0-1 grade group (1.00±0.28). Conclusions: Chronic and consistent ischemia and hypoxia induced the increase of expression of HIF-1α and VEGF-A is important for establishment of coronary collateral, increasing blood supply and improving the heart function and prognosis.

Key WordsCoronary chronic total occlusion;Coronary collateral circulation;Hypoxia-inducible factor 1-alpha;Vascular endothelial growth factor A

通訊作者葛均波，E-mail：ge.junbo@zs-hospital.sh.cn

中圖分類號R 542.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A