徐偉樂(lè)，李輝，秦學(xué)博，侯宏偉，齊海亮

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CCR2和CCR5基因多態(tài)性與結(jié)核性膿胸的關(guān)系

徐偉樂(lè)，李輝，秦學(xué)博，侯宏偉，齊海亮

目的 探討CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A單核苷酸多態(tài)性(SNP)與結(jié)核性膿胸的關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)結(jié)核性膿胸患者300例和健康對(duì)照組300例進(jìn)行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A SNPs檢測(cè)。結(jié)果 與CCR2基因-190 GG基因型相比，攜帶AG和AA基因型均可增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.254，95%CI 1.043～4.868；OR=8.728，95%CI 4.224～18.033)。進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)卡介苗(BCG)接種史、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)<18.5 kg/m2均增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.309，95%CI 2.108～4.382；OR=2.767，95%CI 1.918～3.993)。CCR5基因-59029 G/A 各基因型未入選回歸方程，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CCR2基因-190G/ASNP可能與結(jié)核性膿胸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；CCR5基因-59029G/ASNP可能與結(jié)核性膿胸?zé)o關(guān)。

結(jié)核性膿胸；CCR2基因；CCR5基因；單核苷酸多態(tài)性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.009

結(jié)核性膿胸為胸膜腔結(jié)核桿菌嚴(yán)重感染，并產(chǎn)生膿性滲出液積聚所致，發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)核桿菌侵犯胸膜組織的過(guò)程，是由多種細(xì)胞因子參與的細(xì)胞免疫過(guò)程。CCR2和CCR5作為重要的CC趨化因子受體，具有調(diào)控T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系遷移、增殖與免疫的功能，在炎性反應(yīng)部位募集和活化免疫細(xì)胞中扮演了重要角色?，F(xiàn)采用PCR-RFLP方法對(duì)結(jié)核性膿胸患者進(jìn)行CCR2基因-190 G/A和CCR5基因-59029 G/A 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年1月—2014年1月于河北省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科行手術(shù)治療結(jié)核性膿胸患者300例，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，同時(shí)排除HIV感染者、糖尿病、高血壓、冠心病及有家族遺傳史患者。病程9～12個(gè)月，中位數(shù)10個(gè)月。其中男165例，女135例，年齡23～60歲，中位年齡41.5歲。同期在河北省胸科醫(yī)院體檢中心健康體檢者300例為健康對(duì)照組，其中男159例，女141例，年齡28～59歲，中位年齡43.5歲。2組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。2組對(duì)象性別、年齡、卡介苗(BCG)接種史、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)狀況在經(jīng)當(dāng)事人知情同意前提下由專門的登記員詢問(wèn)調(diào)查。

1.2 觀測(cè)方法

1.2.1DNA提?。?采集每位對(duì)象靜脈血5ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周內(nèi)提取外周血白細(xì)胞DNA。采用蛋白酶K消化—飽和氯化鈉鹽析法。具體操作程序如下：外周血5ml加冷蒸餾水至50ml，2 500r/min室溫離心10min，棄上清。重復(fù)2～3次至紅細(xì)胞完全裂解。加入預(yù)冷的0.1%Triton-X100 45ml同上離心去上清，洗滌1～2次。沉淀加3mlDNA提取液，充分混勻，懸浮白細(xì)胞，加10%SDS150μl(終濃度0.5%)劇烈振蕩至無(wú)凝塊。加入蛋白酶K至終濃度為100μg/ml(1mg/ml約400μl)，混勻，37℃消化過(guò)夜。然后，加入5mol/L的NaCl1.2ml，劇烈振蕩15s，2 500r/min室溫離心15min。將上清倒入另一離心管中，棄沉淀。上清中加入100%乙醇8ml，反復(fù)顛倒混勻，置DNA至高壓滅菌的Eppendorf管中，以70%乙醇洗滌1～2次，倒置Eppendorf管并使乙醇揮發(fā)干凈。以200μlTE溶解DNA，4℃至少放置24h，徹底溶解后經(jīng)電泳或測(cè)OD值定量。

1.2.2PCR擴(kuò)增：CCR2基因-190G/A和CCR5基因-59029G/A引物均參考文獻(xiàn)[1，2]設(shè)計(jì)，由上海伯昊生化科技有限公司合成。-190G/A上游引物序列：5'-CATTGCAATCCCAAAGACCCACTC-3'，下游引物序列：5'-TTGGTTTTGTGGGCAACATGATGG-3'。-59029G/A上游引物序列：5'-CCCGTGAGCCCATAGTTAAAACTC-3'，下游引物序列：5'-TCACAGGGCTTTTCAACAGTAAGG-3'。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5min、94℃變性30s、退火溫度(-190G/A為56℃、-59029G/A為62℃) 30s、72℃ 延伸30s35個(gè)循環(huán)后，最后72℃延伸 5min。1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切： 分別應(yīng)用BsaBI酶對(duì)-190G/A擴(kuò)增產(chǎn)物，Bspl2861酶對(duì)-59029G/A擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分別取酶切產(chǎn)物在3%(-190G/A)和2%(-59029G/A)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以100bpMarker為參照，紫外燈下觀察、拍照并分析其結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。比較各位點(diǎn)基因型頻率的觀察值與預(yù)期值并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)及Hardy-Weinberg平衡分析。以二元Logistic回歸法計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(oddsratio,OR)及95%可信區(qū)間(confidenceinterval,CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分析 (1)健康對(duì)照組-190G/A和-59029G/A位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明樣本來(lái)自于同一人群，具有群體代表性。(2)結(jié)核性膿胸患者CCR2基因-190G/A位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為173bp，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，AA基因型僅見1條173bp電泳帶，AG基因型顯示為173bp、149bp和24bp(24bp不顯示) 3條帶，GG基因型表現(xiàn)為149bp和24bp(24bp不顯示) 2條帶(圖1)。CCR5基因-59029G/A位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為268bp，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，AA基因型僅見1條268bp電泳帶，AG基因型可見3條帶分別為268bp、137bp和131bp，GG基因型表現(xiàn)為137bp和131bp2條帶(圖2)。

注：M.Marker；1,3,7.AA；4,6,11.AG；2,5,8,9,10.GG

注：M.Marker；1,2,4.AA；3,6.AG；5,7.GG

2.2Logistic回歸分析 將BCG接種史、BMI、CCR2基因-190G/A各基因型和CCR5基因-59029G/A各基因型作為自變量，結(jié)核性膿胸組和健康對(duì)照組作為因變量代入二分類Logistic回歸方程，計(jì)算OR值和95%可信區(qū)間。分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于-190G/A位點(diǎn)，與GG基因型相比，攜帶AG和AA基因型均可明顯增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.254, 95%CI1.043～4.868和OR=8.728, 95%CI4.224～18.033)。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)BCG接種史、BMI<18.5kg/m2均可增加結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.309, 95%CI2.108～4.382和OR=2.767, 95%CI1.918～3.993)，見表1。對(duì)于-59029G/A位點(diǎn)，各基因型未選入回歸方程，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明-59029G/ASNP與結(jié)核性膿胸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性。見表2。

表1 回歸方程中的變量

表2 不在回歸方程中的變量

3 討 論

CCR2是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的特異受體，編碼355個(gè)氨基酸殘基蛋白，在各種細(xì)胞類型上都有發(fā)現(xiàn)。MCP-1與CCR2結(jié)合后可趨化多種炎性細(xì)胞，除單核/巨噬細(xì)胞外，還包括記憶和殺傷T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等至炎性病灶而發(fā)揮免疫作用。CCR2基因存在多個(gè)研究SNP位點(diǎn)，其中位于啟動(dòng)子區(qū)的-190G/ASNP可引起不同程度的轉(zhuǎn)錄活性改變，從而影響其蛋白表達(dá)水平及功能,進(jìn)一步影響個(gè)體間對(duì)疾病遺傳易感性的差異。Sezgin等[1]發(fā)現(xiàn)-190G/A位點(diǎn)各基因型在慢性腎衰竭患者和正常人群中分布有顯著性差異，增加慢性腎衰竭發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Miyagishi等[3]發(fā)現(xiàn)在日本人群中-190位點(diǎn)G→A突變與多發(fā)性硬化的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于此位點(diǎn)與結(jié)核病關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，結(jié)論不盡一致，韓銳等[4]采用病例對(duì)照研究，應(yīng)用MassARRAY技術(shù)對(duì)-190G/A位點(diǎn)進(jìn)行基因研究，發(fā)現(xiàn)CCR2基因-190G/ASNP與中國(guó)漢族兒童結(jié)核病易感不存在相關(guān)性。而在對(duì)印度中北部Sahariya部落人群的研究中顯示[5]，對(duì)照組的AA基因型和A等位基因的頻率明顯高于結(jié)核病組，AA基因型對(duì)于結(jié)核病具有保護(hù)作用。本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)河北地區(qū)結(jié)核性膿胸患者與健康對(duì)照組的病例—對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，CCR2基因-190G/ASNP與結(jié)核性膿胸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，即攜帶A等位基因會(huì)增加結(jié)核性膿胸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步通過(guò)分層分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)卡介苗接種史、BMI<18.5kg/m2增加人群患結(jié)核性膿胸的風(fēng)險(xiǎn)。造成各研究結(jié)果的差異可能原因如下：(1)CCR2基因-190G/ASNP本身是一種功能性還是無(wú)意義性突變?nèi)晕闯啥ㄕ摚?2)樣本量的大小不同；(3)不同人群、種族基因型分布頻率的多樣性。

總之，結(jié)核性膿胸的發(fā)病是一個(gè)多因素參與的錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，其中易感基因多態(tài)性影響人類對(duì)結(jié)核性膿胸易感性。限于樣本量、遺傳背景差異等因素，報(bào)道結(jié)果存在差異。因此，大樣本量、不同種族人群的進(jìn)一步研究對(duì)闡明SNP在結(jié)核性膿胸發(fā)生機(jī)制中的作用具有重要的意義。

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Association of CCR2 gene and CCR5 gene polymorphisms with the risk of tuberculous empyema

XUWeile,LIHui,QINXuebo,HOUHongwei,QIHailiang.

DepartmentofMinimallyInvasiveSurgery,HebeiThoracicHospital,Shijiazhuang050041,ChinaCorrespondingauthor:QIHailiang,E-mail:kk20140612@126.com

Objective To investigate the relationship of CCR2 gene-190 G/A, CCR5 gene-59029 G/A single nucleotide polymorphism (SNP) and tuberculous empyema.Methods Using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method, 300 cases of tuberculous empyema patients and 300 healthy control were received 190 G/A and 59029 G/A SNPs detection.Results Compared to CCR2 gene-190 GG genotype, carrying AG and AA genotype can increase the risk of tuberculous empyema (OR=2.254, 95%CI 1.043-4.868; OR=8.728, 95%CI 4.224-18.033). Stratified analysis revealed that, without Bacillus Calmette Guerin (BCG) vaccination history, body mass index (BMI) <18.5 kg/m2were all increased the risk of tuberculous empyema (OR=3.309, 95%CI 2.108-4.382; OR=2.767, 95%CI 1.918-3.993). CCR5 gene-59029 G/A genotypes were not selected in the regression equation, no statistical significance was found (P>0.05). Conclusion CCR2 gene-190 G/A SNP might be related to the tuberculous empyema. CCR5 gene-59029 G/A SNP may have no association with tuberculous empyema.

Tuberculous empyema; CCR2 gene; CCR5 gene; Single nucleotide polymorphism

050041 石家莊，河北省胸科醫(yī)院微創(chuàng)外科

齊海亮，E-mail:kk20140612@126.com

2014-11-08)