陳麗萍，劉 雄，夏鵬飛，樊 秦，趙 磊

當(dāng)歸藥用部位為傘形科植物當(dāng)歸Aaugellica sinensis(Oliv)Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效［1］。主要有效成分為阿魏酸、藁本內(nèi)酯及其異構(gòu)體、多糖等［2］。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸的主要水溶性成分，具有促進(jìn)造血、增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射損傷、鎮(zhèn)痛及抗氧化等廣泛的藥理作用和生物活性［3-5］，現(xiàn)已成為當(dāng)歸藥效成分研究的熱點(diǎn)之一。植物多糖的含量測(cè)定現(xiàn)多采用苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法。蒽酮－硫酸顯色法在一定程度會(huì)受到色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)的干擾，且受試驗(yàn)者操作方法的影響較大。本研究在苯酚－硫酸法的基礎(chǔ)上［6］，采用正交設(shè)計(jì)L9(34)優(yōu)化顯色條件，建立了當(dāng)歸多糖的含量測(cè)定方法，為進(jìn)一步科學(xué)評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材質(zhì)量，合理有效利用藥材資源，提供了一定依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材來源 本實(shí)驗(yàn)所用當(dāng)歸藥材采于甘肅渭源會(huì)川，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥學(xué)教研室楊福德教授鑒定，為傘形科植物當(dāng)歸Angeclica sinensis(Oliv)Diels的干燥根。

1.2 儀器 UV-1800可見－紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、LG-500A型十兩裝高速中藥粉碎機(jī)(山東益康中藥機(jī)械有限公司)、水浴鍋(北京恒豐儀器公司)。

1.3 試藥 葡萄糖對(duì)照品購于中國藥品生物制品檢定所(批號(hào):0831-9603)，苯酚(重蒸餾AR，百世化工公司)，無水乙醇、濃硫酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液:精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0．125 g，置于250 ml量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0．5 mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。吸取該葡萄糖對(duì)照品溶液25 ml，于50 ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0．25 mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 苯酚溶液的配制:精密稱取苯酚12．5 g，置于250 ml棕色容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，定容至刻度，即得5%苯酚溶液，置于4℃冰箱中，冷藏備用。該試劑宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.3 供試品溶液的制備:取當(dāng)歸樣品粉末(過40目篩)約0．5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇100 ml加熱回流l h，抽濾;取濾渣加水60 ml加熱回流2 h，趁熱過濾，將濾液定容至100 ml量瓶中，即得。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 最大吸收波長的選擇:精密吸取質(zhì)量濃度為0．5 mg/ml的對(duì)照品溶液0．5 ml于10 ml干燥具塞試管中，加入濃硫酸6 ml、新配制的5%苯酚1．5 ml，以蒸餾水補(bǔ)足試液至刻度，搖勻，沸水浴加熱15 min后，立即置冰水浴中冷卻5 min。另以2．5 ml蒸餾水同上平行操作為空白對(duì)照組。將試液于300～600 nm處做全波長掃描，最大吸收波長確定為483 nm。最大波長掃描圖見圖1。

圖1 葡萄糖對(duì)照品溶液最大波長掃描圖

2.2.2 顯色條件的選擇:根據(jù)文獻(xiàn)［7］，選擇苯酚用量、濃硫酸用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為考察因素，每因素各取3個(gè)水平，按2．2．1項(xiàng)下方法，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選最佳顯色條件，并運(yùn)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。因素與水平安排見表1，正交設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2，吸光度值的方差分析結(jié)果見表3。通過對(duì)吸光度的測(cè)定結(jié)果(表2)予以直觀分析后可以看出，對(duì)該法顯色的影響因素順序?yàn)?B＞A＞C＞D，即濃硫酸的用量對(duì)顯色影響最大，其次是苯酚用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，并得出該正交實(shí)驗(yàn)的最佳組合為A2B3C3D1，即:苯酚 1．5 ml、濃硫酸 7 ml、反應(yīng)溫度100℃、反應(yīng)時(shí)間為10 min。由表3的方差分析結(jié)果表明:濃硫酸用量對(duì)顯色具有極顯著的影響性意義，苯酚用量對(duì)顯色影響有顯著性意義，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色影響不明顯。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 吸光度值測(cè)定結(jié)果(x±s)

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取質(zhì)量濃度為0．25 mg/ml葡萄糖對(duì)照品溶液 0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 ml置于 10 ml干燥具塞試管中，在已優(yōu)化的顯色條件下，按2．2．1項(xiàng)下方法于483 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，以葡萄糖對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，求得回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=41．9771x+0．1489(R2=0．996)。結(jié)果表明葡萄糖在質(zhì)量濃度為0.005～0．02 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度值的線性關(guān)系良好。葡萄糖對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 葡萄糖對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取0．5 mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液0．5 ml，按照2．3項(xiàng)下方法在483 nm處連續(xù)6次測(cè)定吸光度，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0．69%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取當(dāng)歸樣品粉末0．5 g，按照2．1．3項(xiàng)下方法及2．3項(xiàng)下方法顯色后，室溫放置20、40、60、80、100、120 min 測(cè)定吸光度，RSD為1．16%，表明溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的供試品溶液6份，分別加入0．5 mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液 8．5、10．0、11．5 ml，按 2．3 項(xiàng)下方法顯色后分別測(cè)定吸光度，測(cè)得當(dāng)歸多糖的平均回收率為101.38%，RSD為1．219%。見表4。

表4 當(dāng)歸多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 當(dāng)歸多糖的含量測(cè)定 取3批次當(dāng)歸藥材粉末0．5 g，精密稱定，按照 2．1．3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用已優(yōu)化的顯色條件進(jìn)行分析，測(cè)定吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算當(dāng)歸粗多糖含量(以葡萄糖量計(jì)算)。當(dāng)歸粗多糖含量測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 當(dāng)歸粗多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

當(dāng)歸多糖精制過程煩瑣，耗時(shí)耗力，且樣品的損耗較大，故本實(shí)驗(yàn)采用苯酚－硫酸法測(cè)定當(dāng)歸多糖粗品含量。其原理是多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，該衍生物與苯酚縮合，產(chǎn)生橙黃色物質(zhì)，在適當(dāng)波長處，其吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系，故可通過該顯色反應(yīng)測(cè)定當(dāng)歸粗多糖含量。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出的多糖最佳顯色條件為苯酚 1．5 ml、濃硫酸 7 ml、反應(yīng)溫度 100℃、反應(yīng)時(shí)間為10 min，從而使顯色反應(yīng)條件更加合理可控，保證了多糖定量分析的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，濃硫酸和苯酚用量對(duì)該反應(yīng)的影響較大。濃硫酸滴加時(shí)，應(yīng)迅速準(zhǔn)確，以確?？啡┓磻?yīng)完全。同時(shí)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作的熟練性及操作精度要求較高，試劑加入的速度、振搖時(shí)間、放置時(shí)間、測(cè)定時(shí)間等都要嚴(yán)格把握，否則易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。顯色劑苯酚溶液易氧化，宜臨用現(xiàn)配。

苯酚硫酸法靈敏度高，重現(xiàn)性好，易操作，顯色穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)干擾，適合當(dāng)歸多糖的定量分析。

［1］ 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典［K］．一部．北京:中國中醫(yī)藥科技出版社，2010:124-125．

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