韋志友，丁軍穎，劉清泉

β-內(nèi)酰胺酶最早發(fā)現(xiàn)于1940年，迄今發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶已逾500種，新發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶數(shù)目與日俱增。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陽性菌主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌、分枝桿菌、放線菌及鏈霉菌，其種類和數(shù)量遠遠少于革蘭陰性菌。β-內(nèi)酰胺酶可由染色體編碼，亦可由質(zhì)粒介導(dǎo)。其在分子結(jié)構(gòu)、分類及對抑制劑的敏感性和耐藥譜等方面存在諸多差異。

1 β-內(nèi)酰胺酶的分子結(jié)構(gòu)

目前，β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列、立體結(jié)構(gòu)、功能及三者之間的相互關(guān)系已基本明確。β-內(nèi)酰胺酶與D-丙氨酰-D-丙氨酸轉(zhuǎn)肽酶的三維結(jié)構(gòu)相似，二者來源于同一酶家族。不同的β-內(nèi)酰胺酶，其分子一級結(jié)構(gòu)迥異，但三級結(jié)構(gòu)相似。依據(jù)Ambler分類法，B類酶即金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性位點幾乎都有金屬離子Zn2+;B類酶之外的其他類酶，統(tǒng)稱絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，其活性位點都有絲氨酸(Ser70)。絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶在參與底物識別和催化的過程中，均依賴若干高度保守的序列，以一定空間結(jié)構(gòu)協(xié)同發(fā)揮作用。

Ω環(huán)作為特別的聯(lián)體，可把親核水解反應(yīng)所需的水分子準確定位。A類酶中第224位點的精氨酸則可同時定位另一個水分子，此雙水分子同時定位的結(jié)構(gòu)可水解克拉維酸和舒巴坦等;而C類酶無此結(jié)構(gòu)，故不能水解克拉維酸。Ω環(huán)高度保守的第166位點的谷氨酸可促進β-內(nèi)酰胺酶脫?；?。Ω環(huán)與其他聯(lián)體各自作為一個結(jié)構(gòu)域單元，它們之間的相對位置所形成的空腔，即為β-內(nèi)酰胺酶與底物作用的結(jié)合腔。結(jié)合腔中央是酶的活性位點Ser70。Ser70的－OH、－NH－與237位點的丙氨酸殘基的－NH－共同構(gòu)成“氧離子口袋”，使抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基極化，形成酰化酶復(fù)合物。

β-內(nèi)酰胺酶的活性部位結(jié)構(gòu)，不論是源于染色體還是質(zhì)粒，都有一個α螺旋結(jié)構(gòu)域與5條反向平行的β片層結(jié)構(gòu)，因此，結(jié)合腔與“氧離子口袋”的位置關(guān)系恰是α螺旋結(jié)構(gòu)域的外層與內(nèi)層的關(guān)系，該α螺旋結(jié)構(gòu)域其實更像是“@”形的結(jié)構(gòu)。通過氨基酸的替換使結(jié)合腔的結(jié)構(gòu)改變，從而具有較大空間位阻的底物可到達活性位點與Ser70結(jié)合，這是細菌對抗生素耐藥及耐藥譜擴大的重要機制。

金屬β-內(nèi)酰胺酶已被證實的部分酶為晶體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)主要相似之處為:都有與Zn+結(jié)合的保守系列HXHXD區(qū)，即116～120位點氨基酸;均有一個同樣的αββα的夾心結(jié)構(gòu)，其外側(cè)為兩個α螺旋，中心為β片層，β片層一端含有Zn+結(jié)合位點。因所含金屬離子數(shù)目各不相等，形成了酶與底物結(jié)合方式的多樣化。該類酶主要是通過金屬離子與氨基酸形成配位化合物以干預(yù)活性位點的反應(yīng)。而活性位點與Zn+親和力的強弱不一，這是各金屬酶水解能力互異的重要原因。

2 β-內(nèi)酰胺酶的分類

總體上分為活性位點含絲氨酸殘基的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶與活性依賴金屬離子(多為Zn2+)的金屬β-內(nèi)酰胺酶。該分類方法有助于臨床對酶抑制劑的選擇。

1995年Bush-Jacoby-Medeiros(B-J-M)分類法形成并被普遍接受［1］。該法根據(jù)抑制劑、底物及結(jié)構(gòu)的不同，把β-內(nèi)酰胺酶劃分為4群。與此同時，根據(jù)氨基酸與核苷酸序列的不同，各群又分屬于相應(yīng)的分子類型(表1)。第1群大多為染色體介導(dǎo)，少數(shù)由質(zhì)粒介導(dǎo)，均屬于不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶。第2群由8個亞群組成，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，其中，少數(shù)不被克拉維酸抑制。該群酶的種類和數(shù)量較多，多為質(zhì)粒介導(dǎo)。第3群由3個亞群組成，其活性依賴金屬離子(多為Zn2+)的參與，因此又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶。該群酶可使幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素失活，如2010年引起全球廣泛關(guān)注的New Delhi metallo-β-lactamases-1(NDM-1)就是一個耐藥性超強的金屬β-內(nèi)酰胺酶［2］，故該群酶臨床上需要特別注意鑒別。隨著NDM-1超級細菌的發(fā)現(xiàn)，研究者逐漸將目光更多地投向金屬β-內(nèi)酰胺酶的研究，該群酶對氨曲南敏感，可被乙二胺四乙酸(EDTA)、菲咯啉及巰基化合物抑制［3］。第4群為青霉素酶，不為克拉維酸所抑制，分子類別待定，并尚不清楚是否被EDTA抑制。

表1 β-內(nèi)酰胺酶Bush-Jacoby-Medeiros分類

3 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)的耐藥機制

抗生素是對細菌的生存構(gòu)成的選擇性壓力之一，而細菌耐藥則是對該壓力做出的自然選擇。在該壓力作用下，少數(shù)細菌成為“持留菌”并繼續(xù)生長繁殖，“持留菌”被認為是當前細菌感染治療無效的主要因素［4-6］。新近研究逐步揭示了“持留菌”耐藥機制，即“蛋白網(wǎng)絡(luò)”理論的提出［7］，有望使臨床耐藥菌感染的治療獲得突破性進展。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生與自然界微生物生成的β-內(nèi)酰胺類抗生素的刺激有關(guān)，與之相關(guān)的抗生素耐藥性繼而產(chǎn)生，因此在發(fā)現(xiàn)和使用β-內(nèi)酰胺類抗生素之前，該產(chǎn)酶菌的耐藥性已經(jīng)存在。日益廣泛而大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用，甚至濫用，加速了β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酶菌耐藥性的形成及復(fù)雜化，以致耐藥菌株不斷增多。其機制除了“持留菌”的因素，還與某些β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)酶菌基因高突變有關(guān);另外，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶敏感菌株通過外源性質(zhì)?；?和)轉(zhuǎn)座子的橫向傳遞，接受相關(guān)的耐藥基因而耐藥［8-10］。β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因又可聯(lián)合其他類抗生素耐藥基因編碼重組，導(dǎo)致多重耐藥菌株產(chǎn)生，并且其耐藥水平藉此增強。細菌的耐藥水平是多種機制綜合作用的結(jié)果［11］，這一認識解釋了單個抗生素在治療細菌感染時往往無效甚至容易引起耐藥的原因，也是抗生素復(fù)合制劑研發(fā)的理論依據(jù)。

細菌的耐藥機制從不同的層次和角度看有不同的解釋，與“蛋白網(wǎng)絡(luò)”理論相區(qū)別的細菌耐藥的經(jīng)典理論因基于細菌與抗生素相互作用的特異性而被視為“靶標理論”?！鞍袠死碚摗毕碌募毦退帣C制主要有5種:①生成體外生物膜，阻止抗生素的滲透。②細胞壁外膜孔蛋白減少、缺失或突變，抗生素無法導(dǎo)入菌體。③細胞壁外排系統(tǒng)主動泵出，進入菌體的抗生素達不到殺菌濃度。④青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變，以致抗生素不能干擾細胞壁的合成。該機制是革蘭陽性菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，提示其與革蘭陽性菌的β-內(nèi)酰胺酶主要是胞外酶有某種相關(guān)性。胞外酶是革蘭陽性菌分泌至菌體外的β-內(nèi)酰胺酶，其中也有少量黏附在細胞質(zhì)膜上。革蘭陽性菌中只有葡萄球菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶［12］。⑤生成滅活或鈍化酶類。這其中除了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基苷類抗菌藥物鈍化酶及大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物鈍化酶外［13］，β-內(nèi)酰胺酶是最具臨床意義的，因為臨床所見的耐藥菌，約80%與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有關(guān)［12］。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶并通過水解或非水解的方式使β-內(nèi)酰胺類抗生素滅活則是革蘭陰性菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素耐藥的主要機制，與革蘭陰性菌的β-內(nèi)酰胺酶主要存在于周質(zhì)間隙成為胞內(nèi)酶也有某種相關(guān)性，其中有少數(shù)可通過滲透的方式轉(zhuǎn)移到細胞外:①非水解方式是指抗生素分子到達周質(zhì)間隙后，β-內(nèi)酰胺酶與之合成無活性而極其穩(wěn)定的共價化合物，使之無法作用于青霉素結(jié)合蛋白的靶位而失活。相關(guān)報道中，該方式較水解方式要少見。②水解方式對于金屬β-內(nèi)酰胺酶而言，其活性位點上的金屬離子，通常是Zn2+與相關(guān)氨基酸結(jié)合導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞，進而使抗生素失效。對于絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶而言，這是較多見的方式。其水解過程為:絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶與抗生素結(jié)合成非共價鍵Michaelis復(fù)合體，接著該酶活性位點上絲氨酸的自由羥基侵襲β-內(nèi)酰胺環(huán)，生成共價酰酯，酰酯水解使β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)，經(jīng)重排后酶失活，同時抗生素自身也被滅活［14］。

總之，影響β-內(nèi)酰胺酶致細菌耐藥的因素，就其自身而言，與酶的種類、數(shù)量、位置、動力學(xué)及生理生化情況等相關(guān);就抗生素而言，與其種類、有效濃度及其與青霉素結(jié)合蛋白的親和力等有關(guān);另外，還與細菌所處的外界環(huán)境有關(guān)，如溫度、酸堿度、誘導(dǎo)劑或培養(yǎng)基等。

4 β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑包括β內(nèi)酰胺類和非β內(nèi)酰胺類兩大類。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的抗菌活性極弱，但對β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用卻很強。臨床常與相應(yīng)的抗生素聯(lián)合使用而起協(xié)同作用，這是因為它們抑制了β-內(nèi)酰胺酶，保留了抗生素的抗菌活性，從而有效對抗細菌的耐藥性。根據(jù)作用機制不同，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑分為非競爭性與競爭性兩大類。競爭性抑制劑按作用性質(zhì)分為可逆與不可逆兩種。其中，不可逆性β-內(nèi)酰胺酶抑制劑在水解反應(yīng)中自身也被破壞，同時導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶不可逆性地被抑制。目前，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑以克拉維酸、碳青霉烯類及半合成的青霉烷酸亞砜與鹵代青霉烷酸為主。臨床上，具體而言有克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦及阿維巴坦，其中前三者稱為 β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)典抑制劑。

4.1 克拉維酸 克拉維酸是1976年英國SmithK-line Beecham公司的Brown等于帶棒鏈霉菌的發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)，是第一個用于臨床的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，對β-內(nèi)酰胺酶具有高度專一性。克拉維酸屬氧青霉烷類，因自然條件下為不穩(wěn)定的油狀液體，故常用的是克拉維酸鉀?？死S酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)為稠合雙內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，其與青霉素和頭孢菌素相異之處為以氧原子取代噻唑環(huán)中的硫原子［15］。當與青霉素類或頭孢菌素類聯(lián)合應(yīng)用時，可使青霉素類和頭孢菌素類對大多產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶微生物的抗菌活性明顯增強。

克拉維酸自身的抗菌活性雖然很弱，但對耐藥的革蘭陽性菌和陰性菌，無論是在體內(nèi)還是體外均有抑制作用，且對不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細菌同樣具有潛在的抑菌活性，是廣譜、強力且不可逆的直接作用于酶活性位點的抑制劑，其可選擇性地和青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，但對Ambler分類中的C類β-內(nèi)酰胺酶無效，對人血清幾乎無相互結(jié)合作用。以克拉維酸為基礎(chǔ)的復(fù)合制劑有阿莫西林克拉維酸鉀和替卡西林鈉克林維酸鉀，前者有廣譜殺菌作用，后者對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及克雷伯菌等多種細菌引起的感染有效。

4.2 舒巴坦 舒巴坦是競爭性不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑［16］，是第二個用于臨床的 β-內(nèi)酰胺酶。舒巴坦即青霉烷砜酸，屬半合成青霉烷砜類。單獨使用抗菌活性低，與克拉維酸比較，二者抑酶譜相似，且都對染色體介導(dǎo)的Ambler分類中的C類酶無效;舒巴坦抑酶活性略差，但穩(wěn)定性較好，抗菌作用較克拉維酸稍強。其抑酶反應(yīng)需要經(jīng)過多步轉(zhuǎn)變形成復(fù)合物才最終使β-內(nèi)酰胺酶失活。因其抑酶作用隨時間延長而增強，又稱進行性酶抑制劑。臨床上注射用的是舒巴坦鈉鹽;口服劑多為復(fù)合制劑，復(fù)合制劑中的抗生素因抑制細胞壁黏肽的生物合成而使其起殺菌作用，故為細菌繁殖階段抑制劑。

舒巴坦相關(guān)的復(fù)合制劑的出現(xiàn)，擴大了舒巴坦的抗菌譜，然而有研究發(fā)現(xiàn)，氨芐西林和舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用于綠膿桿菌的治療卻并未表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用［17］。

4.3 他唑巴坦 他唑巴坦為舒巴坦衍生物，與舒巴坦同屬于青霉烷砜類。他唑巴坦是廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，對Ambler分類中的C類酶有較好抑制作用，該作用比克拉維酸穩(wěn)定而較舒巴坦強，且不會產(chǎn)生誘導(dǎo)酶［18］。此外，他唑巴坦對硫化氫抑制酶、苯唑西林水解酶也有較強的抑制作用。

他唑巴坦的血藥濃度、分布容積及t1/2均隨劑量的增大而增大。在腦膜炎患者的腦脊液中，其濃度可達血藥濃度的32．5%，穿透率則隨劑量的增加可提高23．4% ～43．8%。他唑巴坦的血漿蛋白結(jié)合率為20%～23%，而超半數(shù)以原形的形式經(jīng)腎臟排出。故當腎功能下降，肌酐清除率＜20 ml/min時，給藥間隔相應(yīng)地再延長2 h。血液透析可使血藥濃度減少1/3，而腹膜透析則影響較小。肝功能不全對他唑巴坦的代謝影響較小［19］。

4.4 阿維巴坦 阿維巴坦是非β-內(nèi)酰胺類新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，目前仍處于Ⅲ期臨床試驗階段［20］。這標示著阿維巴坦作為恢復(fù)、提高頭孢他啶抗菌活性的新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開始應(yīng)用于臨床治療。另外，阿維巴坦與頭孢洛林、阿維巴坦與氨曲南及阿維巴坦－頭孢他啶－甲硝唑等復(fù)合制劑的臨床期或臨床前期的研究也在積極進行當中［20］，這主要是因為阿維巴坦雖幾乎無抗菌活性［21］，且對產(chǎn)B類金屬酶的細菌無效［22］，但抑酶譜較克拉維酸、舒巴坦及他唑巴坦廣泛且抑酶作用強度遠遠超出此三者，同時還能恢復(fù)或增強相關(guān)抗生素的抗菌活性，能廣泛并極大程度地增強頭孢他啶與頭孢洛林對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌的抗菌活性［23-25］。

阿維巴坦與β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)典抑制劑的抑酶機制有本質(zhì)的區(qū)別，絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶親核反應(yīng)作用于阿維巴坦酰胺鍵，使之開環(huán)并形成酶－抑制劑的共價結(jié)合物，且不發(fā)生水解，經(jīng)環(huán)合后該共價結(jié)合物分解，而分解的過程為逆反應(yīng)，故阿維巴坦自身結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)［26-28］。因環(huán)合的速率遠遠小于β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)典抑制劑水解開環(huán)的速率，故β-內(nèi)酰胺酶幾乎處于抑制狀態(tài)，即阿維巴坦的抑酶作用具有長效性，這恰好解釋了阿維巴坦和β-內(nèi)酰胺酶共價結(jié)合形成的復(fù)合物的半衰期(7 d)比他唑巴坦(5 h)長的原因［29］。

4.5 尚未臨床使用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑 除了β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)典抑制劑及阿維巴坦外，根據(jù)文獻報道，目前尚在臨床試驗或?qū)嶒炇覚z測的有:BRL-42715、SYN-2190與 SYN-1012、J-110與 J-441、巰基化合物、Ro48-1220與 Ro48-1256、CL-186195與 CL-186695 及 LL-10G586［30-33］。

5 β-內(nèi)酰胺酶中醫(yī)藥相關(guān)的研究

近10年來，在中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的研究方面，中醫(yī)藥對β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用不容忽視。黃通旺等［34］研究結(jié)果表明，石芽茶、大蒜、黃柏及谷精籽有不同程度的抑菌作用。林青雯等［35］研究結(jié)果表明，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌對粗糠茶的乙酸乙酯部分高度敏感，抑菌環(huán)為17 mm，最小抑菌濃度(MIC)＞2048μg/ml。梁曉誼等［36］研究發(fā)現(xiàn)，中藥組方黃連液聯(lián)合麝香對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有顯著的抑菌作用。何明等［37］研究發(fā)現(xiàn)，清開靈、雙黃連聯(lián)合頭孢哌酮－舒巴坦鈉對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌有不同程度的抑制作用。高潔等［38］研究提示，抑制β-內(nèi)酰胺酶水解可能是芪歸銀方干預(yù)耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥的機制之一。司紅彬等［39］研究發(fā)現(xiàn)，冬青科植物鐵冬青樹皮的水提取物可明顯降低產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌對諾氟沙星、阿莫西林及加替沙星等多種抗生素的MIC值，且該中藥作用后電鏡下的大腸桿菌干癟、縮短，其細胞壁皺裂、折疊。牛瑞麗等［40］研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方聯(lián)合抗菌西藥治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌引起的泌尿系感染比單用抗菌西藥的療效更顯著。雖然中藥聯(lián)合西藥(抗生素)以抑制β-內(nèi)酰胺酶并逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的研究還不夠深入，同時也只是針對細菌耐藥機制進行的研究方向之一，然而中醫(yī)整體觀念和辨證論治理論指導(dǎo)下的抗耐藥性及抗感染治療，更多的是借助中醫(yī)藥的介入，使中藥的多成分、多功能及多靶點等優(yōu)勢和潛能充分、綜合發(fā)揮作用，中醫(yī)藥的相關(guān)研究在細菌感染及其耐藥方面有著不可替代的作用。具體而言，一方面，通過提高感染病體的正氣間接消滅病原體、清除感染灶同時恢復(fù)機體損傷部位;另一方面，直接抑制或殺滅病原體?！暗鞍拙W(wǎng)絡(luò)”理論的最新提出，從細菌個體的這樣一個“整體”水平對細菌耐藥機制進行研究，而中醫(yī)藥相關(guān)的研究已經(jīng)上升到細菌與感染病體兩者共同構(gòu)成的整體的水平，所以，可預(yù)見隨著中醫(yī)藥相關(guān)研究的深入，其功效將較單純的西醫(yī)西藥更勝一籌。

綜上所述，隨著國內(nèi)外β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)研究的深入，β-內(nèi)酰胺酶的新種類不斷被發(fā)現(xiàn);細菌耐藥機制逐漸變化，新耐藥菌株也不斷產(chǎn)生［41］。因此，有必要對包括β-內(nèi)酰胺酶在內(nèi)的相關(guān)耐藥機制進行進一步深入研究，更有必要對仿耐藥基因抑制劑的中醫(yī)藥進行著力研發(fā)。我國中醫(yī)藥相關(guān)研究雖然較少，但初顯療效［41-43］，期待在該領(lǐng)域取得更大突破，從而為國際醫(yī)學(xué)界耐藥菌防治研究提供新思路。

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