陳 娜，蘇建榮，丁軍穎，洪燕英

混合菌感染多由于創(chuàng)傷性診療方法如氣管插管、氣管切開等應(yīng)用，廣譜抗生素過度使用，加之患者有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、機(jī)體免疫系統(tǒng)功能低下而造成的兩種或兩種以上致病菌或條件致病菌引起的感染［1-2］。如某種抗菌藥物能對(duì)兩種或兩種以上混合菌同時(shí)起抗菌作用，就可以減少應(yīng)用多種抗菌藥物治療混合菌感染而造成的多種抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，混合菌感染組合以大腸埃希菌和屎腸球菌混合感染為主［3］，同時(shí)對(duì)這兩種混合菌起抗菌作用的常用抗菌藥物有氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，而環(huán)丙沙星和左氧氟沙星僅用于泌尿系統(tǒng)感染的補(bǔ)充試驗(yàn)抗菌藥物，氨芐西林屬于常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)抗菌藥物。所以氨芐西林耐藥將會(huì)導(dǎo)致不得不應(yīng)用多種抗菌藥物來治療混合感染，也就會(huì)造成對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性。因此細(xì)菌對(duì)氨芐西林的耐藥情況就顯得尤為重要。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，大腸埃希菌是參與混合感染最多的細(xì)菌，其對(duì)氨芐西林耐藥的機(jī)制主要是β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，對(duì)于單一菌感染大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶國內(nèi)外已有較詳細(xì)的研究，而針對(duì)混合菌感染中氨芐西林耐藥的大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶報(bào)道較少。現(xiàn)就對(duì)大腸埃希菌和屎腸球菌混合感染中氨芐西林耐藥的大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶基因報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(Bio-rad c-100美國)，凝膠成像儀(Tanon 1600美國)。血瓊脂平板培養(yǎng)基(天津金章公司)，MH培養(yǎng)基干粉和19種藥敏紙片(氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢唑啉、厄他培南、頭孢吡肟、慶大霉素、亞胺培南、青霉素-G、頭孢他啶、左氧氟沙星、紅霉素、萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素)為英國Oxoid產(chǎn)品。TEM基因上游引物:5＇-ATCAGCAATAAACCAGC-3 ＇， 下 游 引 物:5 ＇-CCCCGAAGAACGTTTTC-3＇;SHV 基因上游引物:5＇-AGGATTGACTGCCTTTTTG-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-ATTTGCTGATTTCGCTCG-3＇;ampC 基因上游引物:5 ＇-GCCAACGACAAAGGACGC-3＇，下游引物:5＇-ACCTTGCCCTGCTGCTCC-3＇。以上引物均由北京生命科學(xué)研究所合成。PCR反應(yīng)體系總計(jì)40μl，Taq PCR Mix酶 20 μl，上游引物 2 μl，下游引物2 μl，DNA 模板2 μl，超純水14 μl。

1.2 菌株來源 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院細(xì)菌室2010年1月—2014年1月急診及住院患者所分離出的大腸埃希菌和屎腸球菌混合感染24例共48株菌，經(jīng)VITEK2全自動(dòng)微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)鑒定為大腸埃希菌和屎腸球菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923，為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心保存菌株。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn):采用2014年美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)文件推薦的紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。具體步驟:直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個(gè)新鮮菌落，混勻于1．5 ml細(xì)菌稀釋液管中，濁度調(diào)整到與0．5麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng)。用滅菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓，去掉過多的菌液。用拭子涂布整個(gè)MH瓊脂平皿，反復(fù)幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60°，最后沿平皿周邊繞兩圈，保證涂布均勻。MH瓊脂平皿規(guī)格要求為直徑90 mm，厚度4 mm，pH在25℃時(shí)為7．2～7．4。須待平皿上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片，每張紙片間距≥24 mm，紙片中心距平皿邊緣≥15 mm，直徑為90 mm的平皿所貼藥敏紙片不多于6張。貼上紙片后，須在15 min內(nèi)放35℃孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)16～18 h后讀取結(jié)果。判定抗菌藥物抑菌環(huán):培養(yǎng)后取出平皿，測量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為限，當(dāng)質(zhì)控菌的藥物抑菌環(huán)直徑在規(guī)定范圍內(nèi)，再進(jìn)行試驗(yàn)菌的藥物抑菌環(huán)直徑的讀取。

1.3.2 β-內(nèi)酰胺酶基因檢測:采用質(zhì)粒提取試劑盒，操作過程按試劑盒說明書進(jìn)行。方法為堿性裂解法:在電泳加樣孔中，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl加入2%瓊脂糖凝膠，在100 V電壓條件下電泳1 h，用凝膠成像分析系統(tǒng)處理，委托北京生命科學(xué)研究所完成。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 混合菌感染中只有氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)大腸埃希菌和屎腸球菌在用藥上有重疊，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥率達(dá)83．3%。見表1。

表1 大腸埃希菌和屎腸球菌混合菌感染藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.2 β-內(nèi)酰胺酶基因檢測結(jié)果 混合菌感染中24株大腸埃希菌對(duì)氨芐西林耐藥的有20株(83.3%)，有12株檢測出β-內(nèi)酰胺酶基因，其中6株只檢測出單一TEM耐藥基因，1株只檢測出單一ampC耐藥基因，5株同時(shí)檢出TEM和ampC耐藥基因，均未檢出SHV型耐藥基因。見圖1、2。

圖1 部分大腸埃希菌PCR擴(kuò)增TEM基因電泳結(jié)果M:Marker;1～4:隨機(jī)選擇的樣本;N:陰性對(duì)照

圖2 部分大腸埃希菌PCR擴(kuò)增ampC基因電泳結(jié)果M:Marker;1～5:隨機(jī)選擇的樣本;N:陰性對(duì)照

3 討論

混合菌感染較單一菌感染患者的病情更復(fù)雜和嚴(yán)重，加之細(xì)菌間可能存在耐藥基因的相互傳遞，給臨床抗菌藥物治療加大了難度。

臨床對(duì)于混合菌感染的常用抗菌藥物治療方式，多為根據(jù)對(duì)各單一菌感染的經(jīng)驗(yàn)用藥或細(xì)菌室給出的針對(duì)單一菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，分別選取對(duì)各單一菌敏感的兩種或兩種以上抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用來治療混合菌感染，這樣就增加了抗菌藥物的使用種類，同時(shí)也就會(huì)造成多種抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。有研究報(bào)道，大腸埃希菌和屎腸球菌混合感染是最常見的混合菌感染，有革蘭陰性菌參與的感染病理過程更加嚴(yán)重［4］。大腸埃希菌作為混合菌感染組合中所占比例最大的革蘭陰性菌，其對(duì)抗菌藥物的耐藥情況也顯得尤為重要。本研究結(jié)果顯示，同時(shí)對(duì)兩種混合菌起作用的常用抗菌藥物有氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)83．3%。

革蘭陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥的機(jī)制包括:滅活酶的產(chǎn)生;PBP的改變;細(xì)胞膜通透性改變等［5-6］。大腸埃希菌對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制是β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，本研究檢測的β-內(nèi)酰胺酶基因包括 TEM型和 SHV型，質(zhì)粒介導(dǎo)的 ampC酶ampC基因。TEM型、SHV型功能分類屬于2b類酶，結(jié)構(gòu)分類屬于 A類酶［7］，也是產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶的主要基因型，最早由克雷伯菌屬和大腸埃希菌等腸桿菌科產(chǎn)生，由質(zhì)粒介導(dǎo)從TEM-1、TEM-2和SHV-1突變而來［8］。ampC基因?yàn)橘|(zhì)粒介導(dǎo)的ampC酶基因，功能分類屬于1類酶，結(jié)構(gòu)分類屬于C類酶［9］，可見于克雷伯菌、沙門菌、費(fèi)勞地枸櫞酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌和大腸埃希菌，常攜帶大質(zhì)粒。本研究結(jié)果顯示，氨芐西林耐藥的20株大腸埃希菌中TEM型耐藥基因檢出11株(55%)，ampC耐藥基因檢出6株(30%)，未檢出SHV型耐藥基因。檢測出TEM型耐藥基因的大腸埃希菌表現(xiàn)為對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物(包括青霉素類、第三和第四代頭孢、氨曲南)耐藥，但對(duì)碳青霉烯類和頭霉素類藥物敏感。對(duì)酶抑制劑敏感，但使用酶抑制劑復(fù)合制劑不一定有效［10］。檢測出ampC耐藥基因的大腸埃希菌表現(xiàn)為對(duì)一代至三代頭孢、頭霉素、氨基苷類及抗假單胞菌青霉素均耐藥，但對(duì)碳青霉烯類、四代頭孢和氟喹諾酮類敏感。

綜上所述，TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因是混合菌感染中大腸埃希菌對(duì)氨芐西林耐藥的主要耐藥基因，其次是 ampC 基因。與王家平等［11］、丁娟娟等［12］和宋靜靜［13］研究結(jié)果較一致?；旌暇腥局邪逼S西林耐藥的大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺酶基因的研究對(duì)于混合菌感染抗菌藥物治療具有重大意義。

［1］ Cattoir V，Lesprit P，Lascols C，et al．In vivo selection during ofloxacin therapy of escherichia coli with combined topoisomerase mutations that confer high resistance to ofloxacin but susceptibility to nalidixic acid［J］．JAntimicrob Chemother，2006，58(5):1054-1057．

［2］ Holdsworth SR，Law CJ．Functional and biochemical characterisation of the escherichia coli major facilitator superfamily multidrug transporter mdtm［J］．Biochimie，2012，94(6):1334-1346．

［3］ 陳娜，蘇建榮．血培養(yǎng)陽性混合菌感染的病原菌分布及耐藥性分析［J］．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14(6):512-515．

［4］ 方毅，龐立峰，涂婉，等．老年住院患者臨床分離細(xì)菌的分布及耐藥性［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(6):398-401．

［5］ 黃宏勛，盧青松，黃遠(yuǎn)忠．產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭氏陰性菌的耐藥分析［J］．國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2006，12(7):76-77．

［6］ 王芊，華川．銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現(xiàn)狀研究進(jìn)展［J］．解放軍醫(yī)藥雜志，)2013，25(7):87-89．

［7］ 季淑娟，顧儀明，譚文濤，等．中國部分地區(qū)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因型研究［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(9):590-593．

［8］ 鄭金鼎，王予川，楊懷，等．產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的目標(biāo)性監(jiān)測與分析［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(9):1912-1914．

［9］ 吳志恒，郭玉霞，卜婧，等．革蘭陰性菌和革蘭陽性菌血流感染危重患者中致炎癥反應(yīng)的比較［J］．中國感染與化療雜志，2012，12(1):27-31．

［10］鄭為平，史偉峰，王玉月，等．產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌相關(guān)耐藥基因研究［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，13(19):1628-1630．

［11］王家平，王蘇建，張曉敏，等．大腸埃希菌β-內(nèi)酰胺酶、質(zhì)粒ampC酶與Ⅰ類整合酶基因研究［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(10):1201-1203．

［12］丁娟娟，呂曉菊，陳筱純，等．大腸埃希菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥機(jī)制的研究［J］．中國抗生素雜志，2009，34(7):437-440，S4．

［13］宋靜靜．保山市產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌耐藥性及SHV耐藥基因型與其所致感染性疾病研究［J］．大連:大連學(xué)院，2014．