丁軍穎，桂 紅，洪燕英，安世棟，丁雪菲，盧幼然，劉清泉

銅綠假單胞菌屬于革蘭陰性桿菌，在健康人群的呼吸道、腸道和皮膚中廣泛存在，是臨床常見的條件致病菌，可導(dǎo)致全身或局部化膿性感染，嚴(yán)重者可危及生命。隨著臨床治療手段的改善和提高，許多創(chuàng)傷性和介入性的治療方法被應(yīng)用于臨床，加之抗生素逐步升級(jí)，使得銅綠假單胞菌感染率明顯升高且耐藥性日趨嚴(yán)重［1］。外膜蛋白D2(OPRD2)的缺失是銅綠假單胞菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。目前，對(duì)此類耐藥機(jī)制的研究主要集中于實(shí)驗(yàn)株，而關(guān)于臨床分離株的研究報(bào)道較少見［2］。本研究對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院2014年感染病例的送檢標(biāo)本進(jìn)行病原菌分離，統(tǒng)計(jì)分析銅綠假單胞菌的分布情況，檢測臨床分離株中全耐藥菌株的OPRD2耐藥基因的表達(dá)，分析其與耐藥的相關(guān)性，以期為臨床合理用藥，降低感染率，減少耐藥擴(kuò)散提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 搜集2014年1—12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院感染病例的所有送檢樣本15 620例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)衛(wèi)生部2001年1月頒布的醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床診斷。

1.3 病原菌的分離及鑒定 搜集全院感染病例的所有送檢標(biāo)本，包括痰、咽拭子、血、膿及創(chuàng)口分泌物、引流物等，分離病原菌并進(jìn)行革蘭染色(試劑購自天津市金章科技發(fā)展有限公司)，結(jié)合鏡下形態(tài)鑒定，進(jìn)一步培養(yǎng)分離得到銅綠假單胞菌(棄掉同一病例的重復(fù)病原菌)，以備檢測其藥物敏感性。

1.4 銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn) 采用COMPACT VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行菌種鑒定，并進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)檢測。菌種鑒定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰溝腸桿菌ATCC700323，MIC檢測質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。對(duì)20種抗菌藥物均耐藥的銅綠假單胞菌定為全耐藥菌株。

1.5 全耐藥菌株的耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測全耐藥菌株的OPRD2耐藥基因的表達(dá)，引物序列如下，F(xiàn):GCGCATCTCCAAGACCATG;R:GTTGTCGGTGATCGCGTAGC，擴(kuò)增片段預(yù)期長度為252 bp。

2 結(jié)果

2.1 樣本感染情況 15 620例感染樣本中分離非重復(fù)病原菌5075株，革蘭陰性菌3070株，銅綠假單胞菌332株，占6．54%。

2.2 菌株分布特點(diǎn)

2.2.1 樣本形式:332株銅綠假單胞菌，主要來源為痰標(biāo)本116株，占34．94%。

2.2.2 科室分布:銅綠假單胞菌在各科室分布廣泛，幾乎各科室均有銅綠假單胞菌感染樣本，其中，以瘡瘍外科、呼吸科、重癥監(jiān)護(hù)室、綜合保健科和腎內(nèi)科最為多見。銅綠假單胞菌分布居前10位的科室見表1。

2.3 銅綠假單胞菌耐藥情況分析 332株銅綠假單胞菌對(duì)20種不同抗菌藥物的耐藥率差異較大。其中，對(duì)頭孢唑啉的耐藥率最高，為99．4%。對(duì)阿米卡星的敏感率最高，為95．4%;其次為哌拉西林/他唑巴坦，為90．6%。銅綠假單胞菌對(duì)各藥的耐藥情況見表2。

表1 銅綠假單胞菌比例居前10位的科室分布情況

表2 332株銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥情況

2.4 全耐藥銅綠假單胞菌的耐藥相關(guān)基因表達(dá)本研究分離獲得的332株銅綠假單胞菌對(duì)20種抗菌藥均耐藥的有9株，占2．71%。此9株銅綠假單胞菌耐藥基因OPRD2的表達(dá)結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)20種抗生素均耐藥的銅綠假單胞菌OPRD2基因表達(dá)Marker:DL2000;P:陽性對(duì)照;A～I(xiàn):樣本1～9

3 討論

銅綠假單胞菌是院內(nèi)獲得性感染的重要致病菌，在醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)中占第二位［3］。臨床統(tǒng)計(jì)其耐藥率顯著上升，導(dǎo)致相關(guān)治療越來越棘手。本研究分離的銅綠假單胞菌主要來源于痰標(biāo)本，表明其主要引起呼吸道感染。這與張栩［4］的研究一致，提示未來耐藥銅綠假單胞菌的研究和治療應(yīng)主要著眼于呼吸系統(tǒng)的疾病。

已知銅綠假單胞菌存在天然耐藥，隨著抗生素的應(yīng)用使銅綠假單胞菌出現(xiàn)獲得性耐藥和適應(yīng)性耐藥［5］，且三種耐藥機(jī)制可能同時(shí)存在［6］。在銅綠假單胞菌耐亞胺培南的突變株上已證明，外膜通透性降低是由于外膜缺失一種分子量為45～46 kD蛋白OPRD。如將此基因重組于缺陷OPRD的突變株外膜蛋白脂質(zhì)體中，又可使亞胺培南透過性增加5倍以上，其MIC也相應(yīng)地降低，細(xì)菌耐藥性也隨即消除。所以，OPRD2耐藥基因表達(dá)是影響其耐藥性的關(guān)鍵因素［7-9］。沈繼錄等［10-11］以 SDS-PAGE 檢測銅綠假單胞菌的外膜蛋白，發(fā)現(xiàn)亞胺培南耐藥株的OPRD2明顯低于亞胺培南敏感株，也證實(shí)銅綠假單胞菌中外膜蛋白表達(dá)量的減少或缺失是其對(duì)亞胺培南耐藥的重要機(jī)制。本研究也發(fā)現(xiàn)，臨床分離的銅綠假單胞菌菌株中，對(duì)20種抗生素均耐藥的9株菌，其OPRD2耐藥基因表達(dá)率也并非100%，所以提示仍有通透性高的藥物可用于臨床治療。

本研究發(fā)現(xiàn)，2014年臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)頭孢唑啉的耐藥率最高，對(duì)阿米卡星的敏感率最高。有研究報(bào)道，亞胺培南被視為控制革蘭陰性菌感染的最佳抗菌藥物［12］，但本研究結(jié)果與報(bào)道不一致。本研究顯示，銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星敏感率最高，也許與樣本僅來源于本院，有一定局限性有關(guān)。已知亞胺培南可與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞壁合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡，且其對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，曾是治療銅綠假單胞菌感染的首選藥物之一［13-15］。但由于該類藥在臨床大量使用，耐藥率也在逐年上升，這也不難解釋本研究臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南并非最敏感。提示臨床使用亞胺培南治療的原則應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，以適應(yīng)逐年上升的耐藥率［16］。另外，阿米卡星是氨基苷類抗菌藥物，其抗菌譜是氨基苷類抗菌藥物中最廣的，對(duì)銅綠假單胞菌有較好的抑菌作用。有研究對(duì)細(xì)菌耐藥進(jìn)行監(jiān)測顯示，阿米卡星敏感性高達(dá)95%［17］，本研究結(jié)果與此一致。提示阿米卡星臨床治療的可用性。

綜上所述，在關(guān)注銅綠假單胞菌耐藥基礎(chǔ)研究的同時(shí)，有必要對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行更廣泛的耐藥機(jī)制探索研究，以便尋找切實(shí)的治療策略［5-6，18］。

［1］ 洪少勇．某醫(yī)院2013年臨床分離的多重耐藥菌分布及耐藥性分析［J］．武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，23(11):925-929．

［2］ 白永強(qiáng)，韓博，邢亮，等．2011—2013年河北地區(qū)醫(yī)院燒傷患者銅綠假單胞菌耐藥株OPRD基因突變分析［J］．中國病原生物學(xué)雜志，2015，10(1):61-64．

［3］ 齊志麗，段美麗，李昂．銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀［J］．山東醫(yī)藥，2014，54(4):83-86．

［4］ 張栩．485例銅綠假單胞菌院內(nèi)感染的耐藥性及危險(xiǎn)因素分析［D］．長春:吉林大學(xué)，2013．

［5］ 宋玉蘭，趙麗，申子路，等．銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(6):898-900．

［6］ 劉春明．銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(21):4634-4637．

［7］ Al-Bayssari C，Valentini C，Gomez C，et al．First detection of insertion sequence element ISPa1328 in the OPRDporin gene of an imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolate from an idiopathic pulmonary fibrosis patient in Marseille，F(xiàn)rance［J］．New Microbes New Infect，2015，7:26-27．

［8］ Yoneyama H，Nakae T．Mechanism of efficient elimination of protein D2 in outer membrane ofimipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa［J］．Antimicrob Agents Chemother，1993，37(11):2385-2390．

［9］ 張金川，董全紅，潘濤．重癥監(jiān)護(hù)室多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因分型探究［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10(20):2735-2736．

［10］沈繼錄，朱德妹，吳衛(wèi)紅，等．碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌外膜孔蛋白OprD2的研究［J］．中國感染與化療雜志，2011，11(4):281-286．

［11］沈繼錄，方亞平，徐元宏，等．銅綠假單胞菌在碳青霉烯類治療過程中由敏感株發(fā)展為耐藥株的機(jī)制研究［J］．安徽醫(yī)學(xué)，2011，32(5):624-629．

［12］周澤云，張瑜，王瑋．銅綠假單胞菌醫(yī)院感染流行株的耐藥性變遷分析［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25(5):1011-1013．

［13］周發(fā)為．銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制分析［J］．中國社區(qū)醫(yī)師，2015，31(6):6-7．

［14］張倫軍．銅綠假單胞菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的研究［D］．合肥:安徽醫(yī)科大學(xué)，2013．

［15］ Ropy A，Cabot G，Sánchez-Diener I，et al．Role of Pseudomonas aeruginosa Low-Molecular-Mass Penicillin-Binding Proteins in ampC Expression，β-Lactam Resistance，and Peptidoglycan Structure［J］．Antimicrob Agents Chemother，2015，59(7):3925-3934．

［16］何露，曾凡勝，范珍明，等．多重PCR檢測銅綠假單胞菌耐藥基因［J］．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，18(1):12-13，14．

［17］由然，孫立穎．耐阿米卡星銅綠假單胞菌氨基糖苷類耐藥基因及其基因型研究［J］．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(5):341-344．

［18］王芊，華川．銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥現(xiàn)狀研究進(jìn)展［J］．解放軍醫(yī)藥雜志，2013，25(7):87-89．