楊 紅，郎曉芳，王 勇

大量研究表明，氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要原因之一，大量自由基的連鎖反應(yīng)激化，造成細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這個(gè)病理過程是一個(gè)快速級聯(lián)反應(yīng)，各個(gè)環(huán)節(jié)相互影響、互為因果關(guān)系［1-3］。關(guān)于高壓氧治療腦缺血再灌注損傷的研究很多，但其具體作用機(jī)制仍存在較大的爭議［4-5］。銀杏葉提取物注射液(商品名:金納多注射液)是新一代的銀杏葉提取物制劑，主要活性成分是杏黃酮苷和萜類內(nèi)酯，這些活性成分具有捕獲游離基、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)血小板活性等功效［6-8］。段長虹等［9］通過大鼠模型證實(shí)銀杏葉提取物能抑制腦局灶性缺血再灌注損傷。但關(guān)于高壓氧聯(lián)合銀杏葉提取物保護(hù)缺血再灌注腦損傷的研究還未有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對其保護(hù)作用的具體機(jī)制進(jìn)行探討，為今后的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑:銀杏葉提取物注射液(中國臺灣濟(jì)生化學(xué)制藥股份有限公司提供，規(guī)格:17．5 mg/支，批號:140231B);血小板活化因子(PAF)為博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;甘肽過氧化物酶(GSHPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧類物質(zhì)(ROS)活性檢測及丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒均為南京建成生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器:ASD-310S型低溫離心機(jī)為美國Sigma公司提供;DWC450-1150型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙儀器為上海醫(yī)療儀器廠提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取健康清潔級性成熟雄性SD大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)50只，體重250～300 g，術(shù)前6 h禁食水。隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、銀杏葉提取物組(C組)、高壓氧組(D組)和銀杏葉提取物+高壓氧組(E組)，每組10只。

1.3 模型制備及處理 采用改良的Longa等［10］所采取的右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈尼龍線線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型，步驟:大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0．35 ml/100 g)麻醉，將大鼠仰臥位后固定好大鼠四肢于手術(shù)臺上，用生理鹽水清洗干凈頸部后備皮，用碘酊消毒皮膚，75%乙醇脫碘，再用無菌鹽水清洗頸部，頸部正中縱向切開4～5 cm，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)鈍性分離肌肉和深、淺筋膜直至暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、翼腭動(dòng)脈(ICA分支)，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉ECA、ICA，距CCA分叉處0．4 cm處斷離ECA，結(jié)扎遠(yuǎn)心端斷端，在近心端向CCA分叉處牽引，盡量使其與ICA在一條直線上，在ECA斷端插入經(jīng)肝素浸泡的尼龍線線栓，用眼科鑷緩慢推進(jìn)，從血管分叉處開始計(jì)算距離，當(dāng)插入深度約20 mm時(shí)立即停止，結(jié)扎ECA斷端，用無菌生理鹽水清洗干凈后用稀釋的聚維酮碘沖洗切口后立即開始計(jì)時(shí)，阻斷20 min后，重新按照上述方法麻醉、固定大鼠并按上述解剖層次重新暴露血管，緩慢拔出尼龍線線栓至ICA斷端，縫合切口，術(shù)中維持肛溫36．5～37．5℃。各組處理方法:A組切開頸部皮膚、筋膜、肌肉暴露血管后經(jīng)頸靜脈注射相同體積的生理鹽水，并分離頸部血管后縫合切口;B組在插入尼龍線線栓前30 min經(jīng)頸外靜脈給予頸靜脈注射相同體積的生理鹽水;C組在插入尼龍栓線線栓前30 min經(jīng)頸外靜脈給予銀杏葉提取物2 mg/kg;D組在插入尼龍線線栓前30 min經(jīng)頸外靜脈給予頸靜脈注射相同體積的生理鹽水，縫合后將大鼠立即置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物艙內(nèi)，純氧洗艙5 min，使艙內(nèi)氧濃度＞90%，進(jìn)行勻速升壓10 min至2．5 ATA后穩(wěn)壓，吸純氧45 min，減壓15 min后大鼠出艙，處理時(shí)保持通風(fēng)，艙內(nèi)放入少許碳酸鈣以吸收二氧化碳;E組銀杏葉提取物給藥方法同C組，高壓氧治療方法同D 組［11］。

1.4 取材與樣本檢測 分別在再灌注2、3、6、24 h后，抽取大鼠尾緣靜脈血用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定PAF濃度，將血清在離心機(jī)10 000～15 000 r/min離心，勻漿時(shí)間10 s/次，間歇30 s，連續(xù)3或4次，溫度4℃，按試劑盒說明測定GSH-PX、SOD與ROS活性并檢測MDA含量。所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間同一時(shí)點(diǎn)兩兩比較采取單因素方差分析，組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血清氧化相關(guān)物質(zhì) B、C、D、E組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清 GSH-PX、SOD活性均低于A組，而ROS、MDA均高于 A組(P＜0.05);C、D、E組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于B組，而ROS、MDA均低于B組(P＜0.05);D、E組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清 GSH-PX、SOD活性值均高于C組，而ROS、MDA均低于D組(P＜0.05);E組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于 D組，而 ROS、MDA均低于 D組(P＜0.05)。除A組外，其余4組GSH-PX、SOD活性均于再灌注后3 h開始下降，6 h達(dá)到最低值，24 h開始升高，而ROS、MDA均于再灌注后3 h開始升高，6 h達(dá)到高峰，24 h開始下降(P＜0.05)。見表1～4。

表1 5組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間外周血甘肽過氧化物酶水平(x ± s，μmol/L)

表2 5組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間外周血超氧化物歧化酶水平(x ± s，U/ml)

表3 5組大鼠大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間外周血活性氧類物質(zhì)水平(x ± s，U/ml)

表4 5組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間外周血丙二醛水平(x ± s，nmol/ml)

2.2 PAF水平 B、C、D、E組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血清PAF均高于A組，C、D、E組低于B組，D、E組低于C組，E組低于D組(P＜0.05)。除A組外，其余4組PAF均于再灌注后3 h開始升高，6 h達(dá)到高峰，24 h開始下降(P＜0.05)。見表5。

表5 5組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間外周血血小板活化因子水平(x±s，μg/L)

3 討論

目前研究證實(shí)高壓氧治療疾病的機(jī)制主要是在高壓狀態(tài)下，氧氣在組織內(nèi)的溶解量及其彌散程度加大，并經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入人體各組織、細(xì)胞，特別是進(jìn)入缺氧較嚴(yán)重的組織中，進(jìn)一步糾正缺氧，延緩因缺氧導(dǎo)致的組織、細(xì)胞損傷，促進(jìn)組織細(xì)胞的修復(fù)［12-14］。有研究證實(shí)了銀杏葉提取物具有改善微循環(huán)、降低血脂、提高免疫力、抗菌消炎、抗氧化、清除機(jī)體自由基等功效［15-17］，以往大量臨床試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)了銀杏葉提取物對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用［18-21］。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)生成與儲(chǔ)存的重要場所，對缺血缺氧非常敏感，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)部有著完整的抗氧化體系，如SOD、GSH-PX等，還有抗氧化劑如維生素E、維生素C等及機(jī)體自身的調(diào)控技能如脂肪酶、蛋白酶、DNA修復(fù)酶等，體內(nèi)的自由基處于生成和清除的平衡狀態(tài)時(shí)不損傷機(jī)體，腦缺血時(shí)線粒體不能進(jìn)行有氧氧化，三磷腺苷(ATP)產(chǎn)生減少，再灌注血液突然進(jìn)入時(shí)帶來的氧氣只能在蛋白激酶C、髓化過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶催化生成ROS、單線態(tài)氧、過氧化氫和氫過氧基等同時(shí)產(chǎn)生大量類脂類物質(zhì)，大量的ROS、MDA產(chǎn)生，超出了SOD、GSH-PX等酶的清除能力，造成過氧化物質(zhì)集聚，由于神經(jīng)組織具有很高的氧化代謝水平及含量豐富的脂肪酸，易受自由基攻擊［22-24］。本研究結(jié)果顯示，B、C、D、E 組大鼠外周血清中GSH-PX、SOD 活性均較A組降低，而ROS活性與MDA濃度較A組升高，C、D、E組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性均較B組升高，而ROS活性與MDA濃度較B組降低，且E組效果最好。提示缺血再灌注后體內(nèi)存在過氧化損傷與氧化活性物質(zhì)的堆積與抗氧化酶活力降低，而高壓氧與銀杏葉提取物均能很好的提高抗氧化酶活力，降低氧化物質(zhì)的濃度，通過這一途徑保護(hù)腦組織。

PAF作為一種重要的炎性因子，可以通過促進(jìn)血栓形成、降低腦血流量、加重腦水腫等多種方式影響神經(jīng)細(xì)胞功能，并參與腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程［25］。銀杏葉提取物中的銀杏黃酮為重要的PAFR拮抗劑，可競爭性抑制PAF與PAFR結(jié)合，減輕細(xì)胞毒作用，保護(hù)腦細(xì)胞［6］。本研究結(jié)果顯示，B、C、D、E組PAF濃度較A組升高，且C、D、E組較B組降低，E組低于C、D組。提示缺血再灌注損傷后體內(nèi)PAF濃度升高加重腦損傷，銀杏葉提取物與高壓氧能降低其PAF濃度保護(hù)腦組織。

本研究結(jié)果還顯示，除A組外，其余4組GSHPX、SOD活性均于再灌注后3 h開始下降，6 h達(dá)到最低值，24 h開始升高，而 ROS、MDA、PAF均于再灌注后3 h開始升高，6 h達(dá)到高峰，24 h開始下降，結(jié)果與傅敏等［5］研究結(jié)果相同。提示缺血再灌注6 h后氧化損傷最重，24 h后氧化物質(zhì)活性降低，而抗氧化能力逐漸升高。

綜上所述，高壓氧聯(lián)合銀杏葉提取物能很好地降低腦缺血再灌注氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生而保護(hù)腦組織，進(jìn)一步證實(shí)了其抗氧化清除自由基的能力，為今后的臨床實(shí)踐提供了很好的參考價(jià)值。趙旸和黎七雄［26］證實(shí)神經(jīng)苷脂聯(lián)合高壓氧能很好地改善缺血再灌注小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但是銀杏葉提取物聯(lián)合高壓氧對學(xué)習(xí)記憶能力的影響還需要我們?nèi)ミM(jìn)一步研究探討。

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