段志濤，夏金蘭，單 楊，3，*

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙 410083；3.柑橘資源綜合利用國家地方聯(lián)合工程實驗室/湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125）

不同材料固定化柚苷酶的比較

段志濤1，夏金蘭2，單 楊1，3，*

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙 410083；3.柑橘資源綜合利用國家地方聯(lián)合工程實驗室/湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125）

選取殼聚糖、海藻酸鈉、活性炭和氧化石墨烯對柚苷酶進(jìn)行固定化，比較不同材料對柚苷酶的載酶率和固定化酶活，得到較佳的固定化材料為氧化石墨烯，其載酶率達(dá)85.61%，酶活達(dá)410.50 U/g，重復(fù)使用7次后仍能保持72.38%的相對酶活。同時研究了不同條件對氧化石墨烯固定化柚苷酶催化活性影響，得到較佳的固定條件：載酶量為每克氧化石墨烯材料承載60 mg柚苷酶，固定化溫度為20℃，pH值為4.0，固定化吸附時間為9 h，優(yōu)化后氧化石墨烯固定化柚苷酶的酶活為433.70 U/g，重復(fù)使用7次后仍保留78.62%的酶活。

殼聚糖；海藻酸鈉；活性炭；氧化石墨烯；固定化；柚苷酶

柑橘類果汁中含有柚皮苷、新橙皮苷等為代表的黃烷酮糖苷類化合物和以檸檬苦素、諾米林等為代表的三萜類化合物的苦味物質(zhì)［1］。含量較多的苦味物質(zhì)為柚皮苷（4′-5，7′-三羥基二氫黃酮-7-鼠李糖葡萄糖苷）。目前大多利用生物酶法脫苦，該法具有高效、專一、條件溫和、脫苦效果好等優(yōu)勢。柚苷酶（EC 3.2.1.40）具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，主要被應(yīng)用于果汁的脫苦及制藥工業(yè)［2］。柚苷酶分解柚苷主要分兩步完成，柚皮苷被鼠李糖苷酶水解為α-L-鼠李糖和普魯寧，普魯寧的苦味約為柚皮苷的三分之一；普魯寧又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被水解為無苦味的柚皮素和葡萄糖［2］。

但由于目前純柚苷酶制劑成本較高，游離酶又無法回收再利用，而固定化酶既可保持酶的高效性又可回收再使用。雷生嬌等［3-5］選擇殼聚糖、海藻酸鈉、介孔分子篩MCM-41等材料，采用交聯(lián)-吸附或包埋的方法對柚苷酶固定化，取得了一些效果。畢金峰［6］利用活性炭固定化轉(zhuǎn)移α-葡萄糖苷酶，研究發(fā)現(xiàn)固定化酶的酶活較高，穩(wěn)定性好。Zhao等［7］以還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide）為載體，采用非共價吸附的方法對葡萄糖氧化酶和葡萄糖淀粉酶進(jìn)行共同固定化，得到固定化雙酶體系，同氧化石墨烯固定化雙酶相比，固定化酶的活性得到顯著提高。氧化石墨烯的基面上主要是酚羥基和環(huán)氧基團(tuán)，羧基分布在邊緣處［8］。石墨烯氧化物，有巨大的比表面積和豐富的官能團(tuán)，有很好的親水性，是理想的固定化酶載體［9］。

為了找到可以提高固定化柚苷酶的酶活性和重復(fù)使用率較佳的固定化材料，本研究選取了殼聚糖、海藻酸鈉、活性炭和氧化石墨烯4種材料，分別進(jìn)行固定化柚苷酶的研究比較，首次將氧化石墨烯用于固定化柚苷酶。并選出較佳的材料進(jìn)行固定化條件優(yōu)化，為固定化柚苷酶的應(yīng)用發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚苷酶，CAS號9068-31-9，369 U/g；柚皮苷，經(jīng)HPLC檢測純度為98%，美國Sigma-Aldrich公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；殼聚糖（脫乙酰度≥95.0%），Ruibio C4415，Reagent Grade；一縮二乙二醇（diethylene glycol，DEG）（化學(xué)純）、活性炭、氧化石墨烯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Epoch超微量微孔板分光光度計，BioTek Instruments公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SC-15A型電熱恒溫水浴鍋，寧波是海曙天恒儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；Anke TGL-16GA型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 載體的制備

活性炭和氧化石墨烯直接固定化，無需制備成微球。

1.3.1.1 殼聚糖微球的制備

稱取3.5 g殼聚糖，用100 mL φ（醋酸）=2.0%的水溶液溶解，配制成ρ（殼聚糖）=3.5 g/100 mL的膠體溶液，并將溶液超聲處理20 min，驅(qū)除氣泡、使其充分溶解。在另一燒杯中配制一定質(zhì)量濃度的NaOH和乙醇混合凝結(jié)液1 000 mL。用10 mL的注射器吸取殼聚糖膠體溶液，逐滴滴入上述凝結(jié)液中制成微球，滴加完后于室溫（25℃）條件下放置3 h，用去離子水反復(fù)洗滌殼聚糖微球直至中性，再用蒸餾水沖洗3次，抽干，4℃冷藏備用［3-10］。凝膠化的殼聚糖微球表面含有豐富的氨基基團(tuán)，以共價鍵結(jié)合的方式，可以得到穩(wěn)定的固定化酶，外界條件的改變不易導(dǎo)致酶分子的脫落［11］。

1.3.1.2 海藻酸鈉微球的制備

制備方法同殼聚糖微球的制備，只是將凝結(jié)液變?yōu)橐欢ㄙ|(zhì)量濃度的CaCl2溶液。在注射器推動力和電場力作用下，原料液滴入低溫CaCl2溶液，迅速固化，形成海藻酸鈣凝膠微球，浸泡，清洗，真空避光，室溫干燥［12］。

1.3.2 不同材料固定化柚苷酶

分別稱取不同質(zhì)量的載體材料（殼聚糖、海藻酸鈉微球1.0 g，活性炭過120目篩且取0.5 g，氧化石墨烯取0.05 g），加入到4 mL 1.0 mg/mL的柚苷酶酶液（pH 4.0，0.2 mol/L醋酸緩沖液）中，25℃恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中吸附6.0 h。再用pH 4.0的醋酸緩沖液洗去固定化酶表面游離酶，收集游離酶液。即得到固定化柚苷酶，4℃冰箱保存。

1.3.3 固定化柚苷酶活力的測定

采用中林改良Davis法［13-14］。利用柚皮苷在堿性條件下及40℃溫度中，能與一縮二乙二醇發(fā)生反應(yīng)。柚皮苷起顯色反應(yīng)（黃色），生成一種叫柚皮苷二氫查爾酮的物質(zhì)。利用此反應(yīng)，可以配制出柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

柚苷酶活力測定。取2 mL柚苷標(biāo)準(zhǔn)溶液400 μg/mL和0.2 mol/L的pH 4.0醋酸緩沖液2 mL置于試管中，在40℃恒溫?fù)u床中預(yù)熱4～5 min，然后向該試管置入0.1 g固定化柚苷酶，保溫30 min，再置沸水中5 min終止酶活，取該反應(yīng)液通過超微量微孔板分光光度計分析柚苷含量，計算酶活。

固定化柚苷酶活力的定義為在40℃，pH 4.0條件下，每分鐘每克固定化酶分解柚皮苷的微克數(shù)表示為一個酶活力［15］，單位U。

1.3.4 固定化柚苷酶載酶率的測定

采用考馬斯亮藍(lán)測蛋白的方法［16-17］。所有材料固定化柚苷酶后，所收集的游離酶液用pH 4.0醋酸緩沖液定容至10 mL，同時取4 mL 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)柚苷酶酶液同樣定容至10 mL，在590 nm處用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量。根據(jù)不同材料固定后剩余游離柚苷酶與未固定化標(biāo)準(zhǔn)柚苷酶計算出不同材料固定化柚苷酶的載酶率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體對固定化柚苷酶的影響

2.1.1 固定化柚苷酶酶活的比較

殼聚糖和海藻酸鈉分別以微球的形式吸附柚苷酶，酶活分別達(dá)到14.34 U/g和12.18 U/g，活性炭也具有較強(qiáng)的吸附能力，其固定化酶活達(dá)20.50 U/g，而氧化石墨烯由于有較大的比表面積和非共價鍵的吸附方式既可以穩(wěn)定地固定化柚苷酶，又可在反應(yīng)時逐步釋放柚苷酶分子，其固定化酶活高達(dá)410.50 U/g，是其他3種材料的20倍以上。

2.1.2 固定化柚苷酶載酶率的比較

殼聚糖微球由于本身不太穩(wěn)定，操作時柚苷酶酶液容易使其小部分分散，致使吸附不能完全，載酶率為28.34%。海藻酸鈉微球透明有彈性，載酶率高達(dá)91.81%?；钚蕴糠肿右嘤袠O強(qiáng)的吸附能力，載酶率為76.11%。氧化石墨烯本身具有的很強(qiáng)共價鍵吸附能力，使其載酶率達(dá)85.61%。

2.1.3 固定化柚苷酶重復(fù)使用率的比較

殼聚糖固定化柚苷酶由于本身吸附的不穩(wěn)定性，以及在反應(yīng)時受外在條件如溫度、pH值的影響，使其在多次重復(fù)使用后相對酶活下降迅速。在重復(fù)使用第2次時酶活為第1次的74.31%，第3次為39.96%，第4次為36.73%，第5次為33.80%，第6次為19.13%，第7次使用時已降到15.02%的相對酶活。

海藻酸鈉固定化柚苷酶重復(fù)使用情況見圖1。

圖1 不同使用次數(shù)對海藻酸鈉固定化柚苷酶相對酶活的影響Fig.1 Effect of using times on relative activity of alginate immobilized naringinase

由圖1可見，由于其較強(qiáng)的耐熱耐酸等穩(wěn)定性，海藻酸鈉固定化柚苷酶在使用7次后相對酶活保持在51.78%的水平，隨著使用次數(shù)的增多逐步下降。

活性炭固定化柚苷酶重復(fù)使用情況見圖2。

由圖2可見，由于活性炭的比表面積較小，不能很好地釋放柚苷酶分子，相對酶活迅速下降，3次使用后相對酶活已下降到38.13%，使用7次后為10.57%。

氧化石墨烯固定化柚苷酶重復(fù)使用情況見圖3。由圖3可見，氧化石墨烯固定化柚苷酶的非共價鍵吸附方式可以穩(wěn)定地吸附柚苷酶分子，又可以逐步有效地釋放柚苷酶分子，達(dá)到較好的重復(fù)利用效果，3次使用后仍可以保持在89.18%相對酶活水平，使用7次后仍有72.38%相對酶活。氧化石墨烯大比表面積的石墨片與生物分子均勻附著，并不改變附著的生物分子的天然生化特性，固定化的β-半乳糖苷表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)利用性，經(jīng)過10次重復(fù)使用保留92%以上的酶活性，以及理想的性能［18］。

圖2 不同使用次數(shù)對活性炭固定化柚苷酶的相對酶活的影響Fig.2 Effect of using times on relative activity of activated carbon immobilized naringinase

圖3 不同使用次數(shù)對氧化石墨烯固定化柚苷酶相對酶活的影響Fig.3 Effect of using times on relative activity of graphene oxide immobilized naringinase

2.2 氧化石墨烯固定化柚苷酶工藝條件優(yōu)化

對比殼聚糖、海藻酸鈉、活性炭和氧化石墨烯固定化柚苷酶的酶活、載酶率和重復(fù)使用時的相對酶活情況。可以看出氧化化石墨烯固定化柚苷酶有最高的酶活410.5 U/g，是其他材料的20多倍。載酶率海藻酸鈉為92.81%，氧化化石墨烯為85.61%次之。經(jīng)過重復(fù)使用后殼聚糖、海藻酸鈉、活性炭的相對酶活達(dá)到51.78%甚至更低，氧化化石墨烯經(jīng)過7次使用過后仍保持72.38%的相對酶活。綜合評定氧化石墨烯為較佳固定化柚苷酶材料。為了更好地利用這種新型材料，對其固定化柚苷酶工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 給酶量對固定化柚苷酶活力的影響

取氧化石墨烯粉末0.05 g分別加入到4 mLρ（柚苷酶）分別為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.75 mg/mL的酶液中（pH 4.0，0.2 mol/L醋酸緩沖液）中，25℃恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中吸附6.0 h。在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心10 min，分離游離酶液。即得氧化石墨烯固定化柚苷酶，4℃冰箱中保存后并測酶活，見圖4。

圖4 給酶量對氧化石墨烯固定化柚苷酶活力的影響Fig.4 Effect of different amounts of enzyme on activity of graphene oxide immobilized naringinase

由圖4可見，在柚苷酶質(zhì)量濃度在0.25～1.00 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的增加氧化石墨烯分子間的空隙還未完全吸附完全，當(dāng)質(zhì)量濃度超過1.00 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的增加氧化石墨烯分子已經(jīng)吸附飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加會降低酶活，因此0.05 g氧化石墨烯固定化柚苷酶的較佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，即每克氧化石墨烯材料的載酶率為80 mg。

2.2.2 不同pH值對氧化石墨烯固定化柚苷酶酶活的影響

確定氧化石墨烯固定化柚苷酶的較佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，配制pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸緩沖液，用來配制對應(yīng)pH值的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL柚苷酶溶液4 mL，加入氧化石墨烯粉末0.05 g，25℃恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中吸附6.0 h。在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心10 min，分離游離酶液。即得氧化石墨烯固定化柚苷酶，4℃冰箱中保存后并測酶活，見圖5。

由圖5可見，在pH值小于4.0的酸性條件下氧化石墨烯固定化柚苷酶活力下降迅速，在pH值大于4.0甚至升至中性條件下氧化石墨烯固定化柚苷酶活力下降更加迅速，最適的pH值為4.0。

圖5 pH值對氧化石墨烯固定化柚苷酶活力的影響Fig.5 Effect of different pH values on activity of graphene oxide immobilized naringinase

2.2.3 不同溫度對氧化石墨烯固定化柚苷酶酶活的影響

確定氧化石墨烯固定化柚苷酶的較佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，較佳pH值為4.0。分別取氧化石墨烯粉末0.05 g加入到4 mL、pH 4.0、1.00 mg/mL柚苷酶溶液，在20，25，30，35，40，45，50℃條件下，恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中吸附6.0 h。在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心10 min，分離游離酶液。即得氧化石墨烯固定化柚苷酶，4℃冰箱中保存后并測酶活，見圖6。

圖6 溫度對氧化石墨烯固定化柚苷酶活力的影響Fig.6 Effect of different temperatures on activity of graphene oxide immobilized naringinase

由圖6可知，在氧化石墨烯吸附柚苷酶時，當(dāng)溫度超過室溫25℃時，隨著溫度的升高，相對酶活迅速下降，當(dāng)溫度低于室溫時，氧化石墨烯的吸附能力也有所下降，較佳的吸附溫度為25℃。

2.2.4 不同吸附時間對氧化石墨烯固定化柚苷酶酶活的影響

確定氧化石墨烯固定化柚苷酶的較佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，較佳pH值為4.0，較佳吸附溫度為25℃。分別取氧化石墨烯粉末0.05 g加入到4 mL、pH 4.0、1.00 mg/mL柚苷酶溶液，在25℃條件下，恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中分別吸附0，3，6，9，12，15，18 h后，在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心10 min，分離游離酶液。即得氧化石墨烯固定化柚苷酶，4℃冰箱中保存后并測酶活，見圖7。

圖7 吸附時間對氧化石墨烯固定化柚苷酶活力的影響Fig.7 Effect of different adsorption time on activity of graphene oxide immobilized naringinase

由圖7可見，大多數(shù)吸附時間固定化酶的相對酶活能達(dá)到87.52%以上，當(dāng)吸附時間在6 h時，達(dá)到最大的相對酶活，較佳吸附時間為6 h。

2.2.5 氧化石墨烯固定化柚苷酶條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇對固定化酶酶活力影響較大的因素：氧化石墨烯與柚苷酶酶質(zhì)量比、pH值、吸附溫度、吸附時間進(jìn)行L9（34）正交試驗，確定較佳固定化條件。正交試驗因素與水平設(shè)計及結(jié)果分析見表1。

由表1可知，影響固定化酶比活力的因素主次依次為C、D、B、A，即pH值為氧化石墨烯固定化柚苷酶最重要的影響因素。按照各因素的最好水平選取最優(yōu)固定化工藝為A1B1C2D3，根據(jù)正交試驗所得的較佳工藝條件，進(jìn)行3次平行實驗，測得氧化石墨烯固定化柚苷酶酶活平均值為（433.70±1.14）U/g，高于于正交試驗中9組實驗的酶活最高組。

根據(jù)方差分析可知，A、B、C、D四因素的F比分別為0.11，0.50，4.78，2.62。查表可知F0.05（2，8）= 4.41，F(xiàn)0.01（2，8）=8.65。對于C因素F比＞F0.05（2，8）=4.41，F(xiàn)比＜F0.01（2，8）=8.65，pH值影響顯著，其他因素均不顯著。各個因素對實驗指標(biāo)影響的主次與極差分析相同，即以0.05 g氧化石墨烯加入4 mL質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL（每克氧化石墨烯載酶量60 mg）、pH 4.0的柚苷酶溶液中，在20℃（固定化溫度）恒溫振蕩（180 r/min）2 h，4℃冰箱中吸附9 h。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.1 Orthogonal experimental design and results

3 結(jié)論

分別以殼聚糖、海藻酸鈉、活性炭和氧化石墨烯4種材料對柚苷酶進(jìn)行固定化，通過對固定化酶活、載酶率和重復(fù)使用率的指標(biāo)考察，選出較佳的固定化材料為氧化石墨烯。通過單因素實驗確定了較佳值，并通過正交試驗進(jìn)一步確定實驗因素。氧化石墨烯固定化柚苷酶的較佳條件為每克氧化石墨烯載酶量60 mg、緩沖液pH為4.0、固定化溫度為20℃、吸附時間為9 h。本研究基本確定了一種新型固定化材料氧化石墨烯，并優(yōu)化了氧化石墨烯固定化柚苷酶的條件。

［1］單楊，李高陽.現(xiàn)代生物技術(shù)在柑橘工業(yè)應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2007，23（5）：142-145.

［2］雷生姣，潘思軼.柚（皮）苷酶的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2009（19）：314-318.

［3］雷生姣，余海立，黃超，等.交聯(lián)殼聚糖載體固定化柚苷酶工藝［J］.食品科學(xué)，2013，34（23）：233-238.

［4］雷生姣，潘思軼，肖敏，等.MCM-41固定化柚苷酶脫苦葡萄柚汁［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（1）：189-193.

［5］雷生姣，潘思軼.交聯(lián)海藻酸鈉固定化柚（皮）苷酶［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（1）：232-236.

［6］畢金峰.活性炭固定化α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，26（5）：11-14.

［7］Zhao F，Li H，Jiang Y，et al.Co-immobilization of multi-enzyme on control-reduced graphene oxide by noncovalent bonds：an artificial biocatalytic system for the one-pot production of gluconic acid from starch［J］. Green Chemistry，2014，16（5）：2558-2565.

［8］Kim J，Cote L J，Kim F，et al.Graphene oxide sheets at interfaces［J］.Journal of the American Chemical Society，2010，132（23）：8180-8186.

［9］Zhang Jiali，Zhang Feng，Yang Haijun，et al.Graphene oxide as a matrix for enzyme immobilization［J］.Langmuir，2010，26（9）：6083-6085.

［10］孫素芳，張燕，呂樹芳，等.殼聚糖固定化酶載體小球的研究及制備方法的改進(jìn)［J］.河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，29（2）：168-172.

［11］夏瑩.殼聚糖微球旳制備及其固定化多功能淀粉酶0PMA-N的研究［D］.長春：吉林大學(xué)，2014.

［12］吳秋惠，吳皓，王令充，等.海藻酸鈉微球的制備及其在藥物載體中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（8）：1791-1794.

［13］龍俊敏.柚苷酶活力測定方法的研究［J］.江西林業(yè)科技，2012（3）：28-30.

［14］蔣超，蔡慧農(nóng)，倪輝，等.利用DNS法快速分析及優(yōu)化柚皮苷的酶解過程［J］.微生物學(xué)通報，2014，41（2）：408-415.

［15］崔培梧.Penicillium sp.1523液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶及酶的固定化研究［D］.中南林業(yè)科技大學(xué)，2009.

［16］王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量的研究［J］.天津化工，2009，23（3）：40-42.

［17］裴顯慶.用考馬斯亮藍(lán)染色方法測定蛋白質(zhì)含量［J］.肉類研究，1990（1）：36-37.

［18］Devesh K，Mahe T，Srivastava O N，et al.Immobilization of β-galactosidase onto functionalized graphene nano-sheets using response surface methodology and its analytical applications［J］.PloS One，2012，7（7）：1-13.

Comparative Study of Different Materials Immobilized Naringinase

DUAN Zhitao1，XIA Jinlan2，SHAN Yang1，3，*
（1.Longping Branch Graduate School，Central South University，Changsha 410125，China；2.School of Resource Process and Bioengineering，Central South University，Changsha 410083，China；3.Citrus Resources Comprehensive Utilization of Local and National Joint Project Laboratory/ Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China）

Chitosan，sodium alginate，activated carbon，and graphene oxide were selected to immobilizenaringinase.By comparing the activities of immobilized naringinase and the enzyme-carrying rates of the enzyme carriers，it was found that graphene oxide was the optimal material.The enzyme-carrying rate of graphene oxide was 85.61%and theenzyme activity of graphene oxide immobilized naringinase was 410.50 U/g.The enzyme activity remained 72.38%relative activity after 7 times using.Simultaneously，the effects of different conditions on catalytic activity of graphene oxide immobilized naringinase were studied.It was obtained that the optimal load amount of naringinase per gram of graphene oxide 60 mg，optimal temperature 20℃，optimal pH 4.0，and immobilization adsorption time 9 h.The activity of graphene oxide immobilized naringinase reached 433.70 U/g under the optimized conditions，which remained 78.62%relativity activity after 7 times using.

chitosan；sodium alginate；activated carbon；graphene oxide；immobilization；naringinase

李 寧）

TS201.1

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.03.008

2095-6002（2015）03-0043-06

段志濤，夏金蘭，單楊.不同材料固定化柚苷酶的比較［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（3）：43-48.

DUAN Zhitao，XIA Jinlan，SHAN Yang.Comparative study of different materials immobilized naringinase［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（3）：43-48.

2015-01-22

湖南省科技領(lǐng)軍人才培養(yǎng)項目（2013RS4078）。

段志濤，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程；

*單 楊，男，研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏方面的研究。

。