劇雪華

結(jié)直腸癌是最常見消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率男性居第3位、女性居第2位;其癌癥相關(guān)病死率在惡性腫瘤中位居第四位［1］。每年全世界約有120萬結(jié)直腸癌新發(fā)病例，并有60.9萬人因該病而死［1］。由于早期的診斷和(或)治療，在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的病死率近年來有減低的趨勢。經(jīng)濟(jì)發(fā)展使人民的飲食和生活習(xí)慣、環(huán)境發(fā)生改變，這促使我國我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸增高，病死率也隨之上升，目前我國結(jié)直腸癌發(fā)病率為29.44/10萬，病死率為14.23/10萬，嚴(yán)重威脅我國城鄉(xiāng)居民生命與健康［2］。因此深入探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機(jī)制對于降低其發(fā)病率和病死率具有重要意義。結(jié)直腸癌發(fā)病的確切病因及具體機(jī)制尚不十分確定，目前公認(rèn)的“腺瘤—腺癌”假說提出結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段過程，即結(jié)直腸癌的發(fā)生是正常腸上皮一增生改變、微小腺瘤-早期腺瘤-中期腺瘤-晚期腺瘤-癌-癌轉(zhuǎn)移的演變過程［3］。在這個過程中已證實(shí)有一系列遺傳基因發(fā)生了突變，如在大腸癌發(fā)生過程中的不同階段出現(xiàn)癌基因如K-ras、C-myc等的突變或過表達(dá)，抑癌基因如APC、DCC、MCC、P53、P16等的缺失或突變、MSI(microsatellite instability)頻率變化以及CEA的過表達(dá)等［3，4］。本研究旨在探討白介素 1β (IL-1β)和白介素-6(IL-6)在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用，用ELISA檢測了結(jié)直腸癌患者外周血、正常黏膜組織和腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6水平的變化情況，并分析它們與臨床病理特征的相關(guān)性。研究兩者在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，初步評價(jià)兩者在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用與意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2010年5月至2013年4月結(jié)直腸癌患者56例，其中男28例，女28例;年齡43～86歲，平均年齡(65±12)歲?；颊咴跇?biāo)本收集前均未經(jīng)任何治療。所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)且確定其病理分型。選擇同期我院健康體檢者24例作為對照組，其中男12例，女12例;年齡42～83歲，平均年齡(63±12)歲。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，且所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 IL-1β和 IL-6 ELISA試劑盒購自eBioscience公司。

1.3 標(biāo)本收集 所有受試對象于清晨抽取空腹外周血5 ml，3 000 r/min，離心15 min，收集血清置于于-80℃冰箱備檢。正常黏膜組織和癌組織來自29例手術(shù)切除的結(jié)直癌患者，其中正常黏膜組織至少離癌組織5 cm。

1.4 組織培養(yǎng) 將新鮮分離的正常黏膜組織和腫瘤組織分別剔取脂肪和血塊后，稱重，用加雙抗的D-Hank’s液清洗3次，用手術(shù)剪將組織剪成小快，放入24孔培養(yǎng)板中，往每孔加入含雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)液，置于37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，24 h后收集培養(yǎng)液于離心管中，13 500 r/min離心，吸取上清液儲存于-80℃以備分析IL-1β和IL-6用。

1.5 ELISA檢測 收集所有受試對象的血清及組織培養(yǎng)的上清液，用雙抗體夾心法進(jìn)行人IL-1β和IL-6的ELISA檢測。操作過程均按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞因子的濃度以pg/ml表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，IL-1β和IL-6表達(dá)水平均為計(jì)量資料，以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血中IL-1β和IL-6水平比較 結(jié)直腸癌患者血清中IL-1β和IL-6水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)直腸癌患者不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小及分化程度血清中IL-1β水平間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及TNM不同分期(直腸)血清中IL-1β水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即有淋巴轉(zhuǎn)移者IL-1β水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，IL-1β水平隨著TNM分期(直腸)增加反而減少;結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及不同TNM分期(直腸)血清中IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 血清IL-1β，IL-6的表達(dá)與CRC患者的關(guān)系pg/ml，±s

表1 血清IL-1β，IL-6的表達(dá)與CRC患者的關(guān)系pg/ml，±s

注:與無轉(zhuǎn)移比較，*P＜0.05;與Ⅰ～Ⅱ期比較，#P＜0.05

參數(shù) IL-1βIL-6性別男(n=28) 8.1±0.6 29.8±3.6女(n=28) 7.7±0.5 26.0±1.6年齡(歲)≤60(n=21) 8.8±0.7 24.8±2.2＞60(n=35) 7.4±0.4 29.8±2.8腫瘤大小(cm3)＜5(n=31) 7.6±0.5 27.3±2.5≥5(n=25) 8.3±0.6 28.6±3.1腫瘤部位結(jié)腸(右、左)(n=17) 8.8±0.8 26.8±3.1乙狀結(jié)腸(n=10) 7.4±0.7 21.6±1.4直腸(n=29) 7.6±0.5 30.7±3.2腫瘤分化高分化;中度分化(n=39) 7.8±0.4 28.1±2.4低分化(n=17) 8.2±0.9 27.4±3.4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無轉(zhuǎn)移(n=29) 8.7±0.6 23.6±1.8有轉(zhuǎn)移(n=27) 7.0±0.4* 32.5±3.4* TNM分期結(jié)腸Ⅰ～Ⅱ期(n=14) 9.2±0.8 22.1±2.3Ⅲ～Ⅳ期(n=13) 7.2±0.8 27.8±3.5直腸Ⅰ～Ⅱ期(n=11) 8.9±0.9 22.1±2.8Ⅲ～Ⅳ期(n=18) 6.7±0.4* 36.0±4.5*

2.2 結(jié)直腸癌患者正常黏膜組織和腫瘤組織中IL-1β和IL-6水平的檢測 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-1β水平與正常黏膜組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)直腸癌患者不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小組織培養(yǎng)液中IL-1β水平間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及不同TNM分期間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)直腸癌患者不同TNM分期腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

3 討論

IL-1β和IL-6作為一類多效性促炎性細(xì)胞因子在慢性炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-1β和IL-6的表達(dá)譜相當(dāng)廣泛，許多細(xì)胞如上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等都能分泌該類因子，IL-1β和IL-6的表達(dá)在人類乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、頭頸部腫瘤和黑色素瘤等中均有增加，二者參與了腫瘤的形成、侵襲、播散，其高表達(dá)預(yù)示腫瘤患者的不良預(yù)后［5-7］。IL-1β主要由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成并分泌，在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，其通過誘導(dǎo)多種促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子如基質(zhì)金屬蛋白酶、內(nèi)皮黏附分子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、炎癥趨化因子和生長因子基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［5，7，8］。IL-1β表達(dá)水平可判斷病變的發(fā)展進(jìn)程，IL-1β的表達(dá)增高可增加實(shí)體惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。臨床實(shí)驗(yàn)顯示，IL-1β在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期增加呈正相關(guān);IL-1β在外周血中表達(dá)水平也顯著增高，暗示IL-1β在結(jié)直腸癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有重要作用［9］。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種組織細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是參與機(jī)體對腫瘤免疫的重要介導(dǎo)因子，其作為多種腫瘤包括結(jié)直腸癌的生長因子或旁分泌生長因子促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、分裂并延長細(xì)胞的生存，與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［5-7］。腫瘤分化程度越低其IL-6表達(dá)量就越多;腫瘤分化程度越高其IL-6的表達(dá)量越少，而在外周血中IL-6表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著增高，暗示結(jié)直腸癌組織分泌的IL-6量與腫瘤細(xì)胞本身的分化程度有關(guān)［6，7，9］。

表2 腫瘤IL-1β、IL-6表達(dá)與CRC患者的關(guān)系pg/ml，±s

表2 腫瘤IL-1β、IL-6表達(dá)與CRC患者的關(guān)系pg/ml，±s

注:與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移比較，*P＜0.05;與Ⅰ～Ⅱ期比較，#P＜0.05

參數(shù) IL-1βIL-6性別男(n=15) 1 810±254 3 597±331女(n=14) 2 238±470 3 341±349年齡(歲)≤60(n=12) 2 701±492 3 266±314＞60(n=17) 1 534±223 3 620±342腫瘤大小(cm3)＜5(n=15) 1 879±339 3 556±398≥5(n=14) 2 165±400 3 386±258腫瘤部位結(jié)腸(n=12) 2 045±424 3 304±34直腸(n=17) 1 997±339 3 594±327腫瘤分化高分化、中度分化(n=19) 1 876±304 3 634±34低分化(n=10) 2 329±510 3 119±306淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(n=14) 1 230±192 3 832±351有(n=15) 2 751±388* 3 140±306腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ(n=13) 1 286±199 4 101±336Ⅲ～Ⅳ(n=16) 2 610±389# 2 964±244#

IL-1β和IL-6都具有免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖、分化，對機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫都具有重要的調(diào)節(jié)作用，如高濃度的IL-6和TGF-β能促進(jìn)Th17細(xì)胞分化發(fā)育，而IL-1β在初始T細(xì)胞表達(dá)IL-17過程中則是最有效的誘導(dǎo)劑;Th17細(xì)胞及其特征細(xì)胞因子IL-17又是一類促炎性因子，能加速炎性反應(yīng)，它們介導(dǎo)的炎性反應(yīng)能誘導(dǎo)結(jié)直腸腺瘤和結(jié)腸癌的發(fā)生，其中IL-17通過誘導(dǎo)促炎性因子包括IL-1β和IL-6和趨化因子的釋放來介導(dǎo)局部炎性反應(yīng)，使慢性炎性反應(yīng)得以持續(xù)存在［10-12］;在IL-6含量少的情況下，高濃度的TGF-β反而能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化發(fā)育，而Treg細(xì)胞和其特征因子TGF-β是重要的免疫調(diào)節(jié)者，在控制黏膜炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病的過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，如它能調(diào)節(jié)IL-1β的產(chǎn)生從而控制炎性反應(yīng);而高水平的TGF-β則參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤，播散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［13］。結(jié)直腸癌組織中的Treg細(xì)胞能抑制CD+4T細(xì)胞對腫瘤相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，并與疾病的進(jìn)展呈正相關(guān)［13］。但王建升等［11］報(bào)道隨著腫瘤的發(fā)展，TGF-β的表達(dá)有降低的趨勢。盡管本研究沒有檢測TGF-β在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的濃度變化，但可以推測低濃度的TGF-β不能抑制IL-1β、IL-6、IL-17等細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，以致腫瘤微環(huán)境中的慢性炎性反應(yīng)得不到有效控制，從而造成慢性炎性反應(yīng)的持續(xù)存在。然而，究竟什么因素會造成腫瘤進(jìn)展中IL-1β和IL-6的變化仍值得進(jìn)一步探討。另外，高濃度的IL-6還具有直接的免疫抑制作用，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫作用的發(fā)揮，使腫瘤與宿主間的相互關(guān)系變得復(fù)雜化，如IL-6可抑制中性粒細(xì)胞浸潤，促進(jìn)單個核細(xì)胞聚集，從急性炎癥轉(zhuǎn)入慢性炎癥;IL-6又能損傷自然殺傷細(xì)胞的功能，使其無法行使殺腫瘤作用，從而使腫瘤發(fā)展［7，14］。

Piancatelli等［15］報(bào)道結(jié)直腸癌患者血清中的IL-6水平與患者的臨床病理參數(shù)無相關(guān)性，而腫瘤組織中的IL-6水平僅與腫瘤的部位有關(guān)。Esfandi等［14］則報(bào)道結(jié)直腸癌患者血清和腫瘤組織培養(yǎng)液中的IL-6與結(jié)直腸癌的臨床分期呈正相關(guān)。其他研究者報(bào)道結(jié)直腸癌患者血清中的IL-6水平與腫瘤大小及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)［6，7］。IL-6在結(jié)直腸癌患者的血清中增多，能反映了疾病的狀況，血清IL-6可用來監(jiān)控疾病進(jìn)程，但血清中IL-6并不能作為一個惟一的獨(dú)立預(yù)后因子來預(yù)測結(jié)直腸癌的整體生存［7］。盡管有研究者發(fā)現(xiàn)IL-1β在結(jié)直腸癌患者的血清和腫瘤組織中呈高表達(dá)，但與患者的臨床病理參數(shù)無相關(guān)性［7，15］。我們的結(jié)果表明，結(jié)直腸癌患者外周血中IL-1β和IL-6水平與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關(guān)，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期(直腸)相關(guān);腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-1β水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期相關(guān);腫瘤組織培養(yǎng)液中IL-6水平僅與TNM分期相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤微環(huán)境中的炎性細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6通過IL-6/gp130/STAT3信號通路增強(qiáng)與上皮細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，抑制與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的存活和增殖［5］;腫瘤微環(huán)境中的IL-1β通過增強(qiáng)血管的形成而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［8］。這些研究也可解釋我們的結(jié)果，即早期腫瘤組織表達(dá)高濃度的IL-6，對腫瘤細(xì)胞的存活和增殖發(fā)揮重要作用，隨著腫瘤的發(fā)展，IL-1β的表達(dá)逐漸增多，形成有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。

本研究提示，IL-6在腫瘤發(fā)展的早期起作用，而IL-1β則在腫瘤發(fā)展的晚期起作用。盡管我們目前對IL-1β和IL-6的功能有了更深刻地認(rèn)識，但其在腫瘤中的作用了解仍有限，所得的證據(jù)多存在相互矛盾之處;IL-1β和IL-6的表達(dá)尚隨著致病因素、腫瘤的類型和疾病進(jìn)展階段的不同而有所差異，對其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用還需要進(jìn)行深入的研究探討。不過，我們相信隨著對IL-1β和IL-6的研究深入及其機(jī)制的闡明，我們將能把這些新發(fā)現(xiàn)、新成果更好地用于腫瘤的診斷和治療。

1 Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths.CA Cancer J Clin，2011，61:212-236.

2 王寧，孫婷婷，鄭榮壽，等.中國2009年結(jié)直腸癌發(fā)病和死亡資料分析.中國腫瘤，2013，22:515-519.

3 Arends MJ.Pathways of colorectal carcinogenesis.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2013，21:97-102.

4 Cui G，F(xiàn)lorholmen J.Polarization of cytokine profile from Th1 into Th2 along colorectal adenoma-carcinoma sequence:implications for the biotherapeutic target?Inflamm Allergy Drug Targets，2008，7:94-97.

5 Vendramini-Costa DB，Carvalho JE.Molecular link mechanisms between inflammation and cancer.Curr Pharm Des，2012，18:3831-3852.

6 Kinoshita T，Ito H，Miki C.Serum interleukin-6 level reflects the tumor proliferative activity in patients with colorectal carcinoma.Cancer，1999，85:2526-2531.

7 Cui G，Yuan A，Goll R，et al.Serum interleukin-6 levels reflect the disease status of colorectal cancer.J Surg Oncol，2003，83:222-226.

8 Li Y，Wang L，Pappan L，et al.IL-1β promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation.Mol Cancer，2012，11:87.

9 Pellegrini P，Berghella AM，Contasta I，et al.The study of a patient＇s immune system may prove to be a useful noninvasive tool for stage classification in colon cancer.Cancer Biother Radiopharm，2006，21:443-467.

10 Cui GL，Yang H，Zhao J，et al.Elevated proinflammatory cytokine IL-17A in the adjacent tissues along the adenoma-carcinoma sequence. Pathol Oncol Res，2015，21:139-146.

11 王建升，張立志，帖彥清，等.結(jié)直腸癌進(jìn)展中腫瘤浸潤Th17細(xì)胞水平的變化.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24:50-53.

12 王建升，呂元鵬，孟軍濤，等.IL-23和IL-17在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)及意義.中國腫瘤臨床，2014，41:580-584.

13 Landskron G，De la Fuente M，Thuwajit P，et al.Chronic inflammation and cytokines in the tumor microenvironment.J Immunol Res，2014，2014:149185.

14 Esfandi F，Mohammadzadeh Ghobadloo S，et al.Interleukin-6 level in patients with colorectal cancer.Cancer Lett，2006，244:76-78.

15 Piancatelli D，Romano P，Sebastiani P，et al.Local expression of cytokines in human colorectal carcinoma:evidence of specific interleukin-6 gene expression.J Immunother，1999，22:25-32.