彭曉琳，徐 健，郝麗萍，孫秀發(fā)，陳忠偉

(1 南山區(qū)慢性病防治院慢非科，深圳 518054;2深圳市慢性病防治中心，深圳 518020;3華中科技大學同濟醫(yī)學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，武漢 430030)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)屬于非黃酮類多酚化合物，化學名稱為3，5，4'-三羥基二苯乙烯(3，5，4'-trihydroxystilbene)，又稱芪三酚。已有研究表明，白藜蘆醇具有抗癌、抗心血管疾病、抗突變、抗菌、抗炎、抗氧化、誘導細胞凋亡及雌激素調節(jié)等藥理活性［1］。植物化學物的生物利用度及其在體內代謝、轉化等方面的研究是確定植物化學物生物效應的重要基礎。目前，有關白藜蘆醇在動物及人體內的吸收和代謝的研究報道較少，因此，明確白藜蘆醇在體內的吸收代謝情況是當前研究的重點。本研究利用高效液相色譜和氣相色譜-質譜聯(lián)用方法，系統(tǒng)地研究了大鼠灌飼白藜蘆醇后，白藜蘆醇在體內的代謝情況，為深入探討其健康生物學效應和制訂人體推薦攝入量奠定基礎，也為提高白藜蘆醇在體內的生物利用度及應用于臨床提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 器材

Waters 1525 binary HPLC 色譜泵(美國)及熒光檢測器;Hypersil C18(250mm ×4.6mm ×5μm)液相色譜柱及相同填充顆粒的C18保護柱;氣相色譜-質譜(GCMS)聯(lián)用儀(Agilent GC HP 6890/MS HP 5975);SPE C18小柱，N2 吹干儀。

1.2 試劑

白藜蘆醇及白藜蘆醇苷標準品(美國Sigma 公司):純度99%、四蒸水、乙酸乙酯(分析純)、乙醇(分析純)、甲酸(分析純)、正庚烷(分析純)、衍生化試劑BSTFA、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、冰乙酸(色譜純)。

1.3 實驗動物

雄性Wistar 大鼠10 只，體重180～200 g (湖北省動物中心提供)。實驗前禁食10h，照常飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準曲線濃度系列配制

準確稱取白藜蘆醇及反式白藜蘆醇苷各2.0mg，置于15mL 真空離心管中，分別用10mL 甲醇溶解并充分混勻，制成標準儲備液，然后按1∶1 比例混勻，依次稀釋配制成10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/L混合標準濃度系列。然后吸取該混合系列各濃度20μL按選定的HPLC 色譜條件進樣檢測，以峰面積積分值×105為橫坐標(X)、混合標準液濃度為縱坐標(Y)繪制標準曲線。

1.4.2 代謝學色譜條件

(1)HPLC 測定

色譜柱:美國Hypersil ODS-C18(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:35℃;流動相A (甲醇:乙酸:水=10∶2∶88)、B (甲醇:乙酸:水=90∶2∶8);流速1.0mL/min;檢測波長為λex=330nm、λem=374nm;進樣量20μL;梯度洗脫:0min，85% A、15% B;5min，65%A、35% B;8min，65% A、35% B;15min，50% A、50%B;25min，30%A、70%B，待該梯度完成后間隔10min 后使系統(tǒng)回到初始狀態(tài)再繼續(xù)進樣。

(2)GC-MS 測定

色譜條件:進樣口溫度280℃，柱溫采用程序升溫，初溫100℃，保持2min 后，以10℃/min 速度升至300℃，恒溫 10min，載氣為純氦氣，流速為110mL/min。

質譜條件:接口溫度280℃，El 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度106℃，電子倍增器電壓1 400V，質量掃描范圍30～550。

1.4.3 動物給藥方案

動物適應性喂養(yǎng)1w 后，分裝到10 個代謝籠中飼養(yǎng)。實驗前禁食12h，按50mg/(kg·bw)劑量灌胃給以白藜蘆醇。灌胃白藜蘆醇后0min、10min、30min、1h、3h、5h、7h、24h、48h 從大鼠內眥靜脈取血，靜脈血樣置于含肝素鈉的抗凝管中，2 000g 離心10min，按1.4.1步驟處理待測。

1.4.4 品預處理

(1)血漿

100μL 血漿分別加入加100μL 甲酸水溶液(pH=3.5)和300μL 乙腈，漩渦震蕩1min，然后4 000g 離心10min，將上清轉入另一管中，40℃氮氣吹干。再將殘渣重懸于100μL 流動相中，取一定體積進行HPLC 檢測。進行GC-MS 分析時，則需進行衍生化處理，在殘渣中加入一定體積2-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)60℃處理30min 后待測。

(2)尿樣

將得到的鼠尿通過C18柱，然后用乙醇萃取，萃取液用N2吹干儀于45℃吹干。剩下的油性殘渣溶解在流動相中待測。如是進行GC-MS 分析，則需進行衍生化，同前。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇與白藜蘆醇苷HPLC 圖譜

圖1 標準品(A)及樣品(B)中白藜蘆醇及其苷類的HPLC 圖譜

2.2 HPLC 檢測

2.2.1 標準曲線繪制

如圖2 所示，以峰面積×105為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標繪制標準曲線，白藜蘆醇及其糖基化物在0～10mg/L 濃度范圍內線性較好，白藜蘆醇的回歸方程為y=0.050 7x－0.050 6 (R2=0.999 5)、白藜蘆醇苷的回歸方程為y=0.031 4x－0.076 8 (R2=0.999 6)。

圖2 白藜蘆醇及白藜蘆醇苷標準曲線繪制

2.2.2 白藜蘆醇代謝

(1)血漿HPLC 檢測

如圖3 所示，白藜蘆醇進入體內可迅速轉換為其糖基化衍生物，攝入后10min 血液中即可檢測到白藜蘆醇苷，濃度約為10mg/L，3h 后達到高峰，血液中可含23.78mg/L 糖基化苷，5h 后代謝趨緩，到24h 時幾乎代謝完畢;而白藜蘆醇則在攝入后1h 達到高峰，但其含量不到同時段內其糖基化物的1/3，且在3h 后血漿中含量逐漸趨于零。

圖3 大鼠灌飼白藜蘆醇后血漿中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷濃度-時間效應

(2)尿液HPLC 檢測

如圖4 所示，白藜蘆醇原型及其糖基化衍生物主要在白藜蘆醇攝入后24h 內從尿液排泄。24h 內約排出4.26mg 白藜蘆醇原型、0.32mg 白藜蘆醇糖基化衍生物。24～48h 之間僅排出白藜蘆醇原型物質0.03mg、白藜蘆醇衍生化物約0.01mg。

圖4 大鼠灌飼白藜蘆醇后尿液中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷濃度-時間效應

(3)血漿GC-MS 檢測

機體攝入白藜蘆醇1h 后，血漿中代謝產物明顯增加，3h 達到高峰，種類最多，含量也最高，與HPLC 法分析所得結果具有一致性。

3 討論

圖5 GC-MS 法分析不同時間血漿中白藜蘆醇及其代謝物情況

研究顯示，植物化學物的功效學是與其生物利用度及其在體內的代謝途徑，代謝物的組織分布、轉化及排泄等方面密切相關的。本研究發(fā)現，白藜蘆醇攝入60min 后，血漿中白藜蘆醇原型即已出現峰值，但其含量不高;而白藜蘆醇糖基化衍生物3h 后才達到最高，其含量是前者的5 倍，說明白藜蘆醇口服攝入后，主要以糖基化形式進入血漿進行代謝。有研究者報道［2～5］，經腹腔注射白藜蘆醇后不到10min，血漿中白藜蘆醇含量即消除了一半，4～8h 后血漿中白藜蘆醇濃度又急驟上升，發(fā)生了腸肝循環(huán)。本研究通過口服攝入白藜蘆醇則未觀察到這一現象，說明白藜蘆醇的攝入方式是影響其生物利用度的關鍵因素之一。通過氣質聯(lián)用分析發(fā)現，白藜蘆醇經口攝入3h 后，血漿中的代謝產物含量及種類均達到最多，這進一步驗證了白藜蘆醇在血漿中的代謝情況，如前述HPLC 分析結果所示，血漿中白藜蘆醇苷在白藜蘆醇攝入后3h 達到峰值，即白藜蘆醇進入體內后，主要以其各種代謝產物的形式存在。

本研究還發(fā)現，尿液中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量與血漿中完全相反，白藜蘆醇經口攝入(約7～8g)24h后，大量白藜蘆醇原型可經尿液排泄，累計排泄率超過攝入量的一半，而白藜蘆醇糖基化苷則僅有僅有白藜蘆醇原型水平的十幾分之一，不到總攝入量的4%。說明白藜蘆醇在體內可能主要以糖基化物發(fā)揮生物學功效，白藜蘆醇原型在機體內的生物利用率相對較小。研究證明，白藜蘆醇排泄與攝入的是純品還是食物也有關，飲用葡萄汁(主要為白藜蘆醇糖甙形式)后，白藜蘆醇的累積排泄量只有給予同樣劑量的純品的1/10［4］，說明白藜蘆醇的攝入形式會對研究結果產生很大的影響，食物中因含有多種化合物可能會干預白藜蘆醇的吸收。

由此看來，在不同的種屬、不同的純度及食物來源等情況下，白藜蘆醇的代謝情況是存在明顯差異的，在進行白藜蘆醇的某一特殊功效研究時，有必要根據具體的種屬及受試物來評價白藜蘆醇的這一生物學作用，這樣對其應用于臨床及確定治療劑量具有重要的實踐意義。鑒于純品的吸收量和速度都遠遠超過食物，如果白藜蘆醇對機體確實是有益而無害的，那么，食用白藜蘆醇保健品將是預防和治療血管性疾病的重要手段之一。

［1］余慧琳.白藜蘆醇的生理功能及其應用前景［J］.生物學通報，2005，40(11):12-13.

［2］Juan M E，Alfaras I，Planas J M.Determination of dihydroresveratrol in rat plasma by HPLC ［J］.J Agric Food Chem，2010，58(12):7472-7475.

［3］Juan M E，Maijo M，Planas J M.Quantification of transresveratrol and its metabolites in rat plasma and tissues by HPLC ［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51(2):391-398.

［4］Wenzel E，Somoza V.Metabolism and bioavailability of trans-resveratrol ［J］.Mol Nutr Food Res，2005，49(5):472-481.

［5］Andriambeloson E，Kleschyov A L，Muller B，et al.Nitric oxide production and endothelium-dependent vasorelaxation induced by wine polyphenols in rat aorta ［J］.Br J Pharmacol，1997，120(6):1053-1058.