陳建中，楊 春，劉春雷，朱房勇，胡 瑜，李 松△

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，云南昆明650031；2.云南文山州醫(yī)院口腔科，云南文山663000；3.江蘇省無錫市第三人民醫(yī)院口腔科，江蘇無錫214021）

髁突軟骨在生長(zhǎng)發(fā)育中受到各種形式應(yīng)力的作用，這些生物力對(duì)髁突軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育及病理改變起著重要的作用［1-8］。目前關(guān)于應(yīng)力改變?cè)隗w內(nèi)對(duì)髁突軟骨超微結(jié)構(gòu)影響的研究報(bào)道不多，本實(shí)驗(yàn)通過建立年輕大鼠髁突頸部截骨及骨折動(dòng)物模型，造成體內(nèi)應(yīng)力改變的程度不同，利用掃描電鏡（SEM）及透射電鏡（TEM）觀察髁突軟骨組織在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的超微結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步探索應(yīng)力變化對(duì)髁突軟骨影響的機(jī)制及其生理、病理意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 選擇4 周齡雄性SD 大鼠54只（昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心），體質(zhì)量（149±3）g。鑷子、單面刀片、毛筆、日立SD450型SEM、日立H2600型TEM。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為3 組：截骨組（右側(cè)），骨折組（右側(cè)），空白對(duì)照組（右側(cè)）。

1.2.2 髁突頸骨折及截骨的動(dòng)物模型建立 用1%戊巴比妥鈉行大鼠腹腔注射實(shí)施全身麻醉。大鼠右側(cè)耳前1cm 切口，切開皮膚、皮下組織，從顳肌、咬肌及外耳道之間凹陷處進(jìn)入，鈍性剝離暴露髁突頸部，截骨組用自制血管鉗橫行截除髁突頸部分軟骨，髁突頸骨折組用眼科剪剪斷髁突頸，分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后2d內(nèi)喂以精細(xì)食物，再進(jìn)行2d精細(xì)物與常規(guī)飼料的混合喂養(yǎng)，之后恢復(fù)常規(guī)飼料飼養(yǎng)。分別于術(shù)后1、3、5周時(shí)處死SD 大鼠；分成3部分，分別用蘇木素-伊紅（HE）染色、SEM 及TEM 觀察。于截骨組手術(shù)側(cè)（右側(cè)）、骨折組手術(shù)側(cè)（右側(cè)）、對(duì)照組（右側(cè)）取下髁突軟骨。

1.2.3 HE 染色 4%多聚甲醛固定液固定24h。在20%甲酸中脫鈣（約18h），常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，制備4μm 厚石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.2.4 SEM 觀察 樣品用0.1mol／L 磷酸緩沖液（pH7.2）沖洗3次，每次15s。4%多聚甲醛4 ℃條件下固定72h。將標(biāo)本置于30%～100%乙醇逐級(jí)脫水，其中30%乙醇1次，每次10min，100%乙醇2 次，每次10 min，純乙酸異戊酯處理，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子濺射，日立SD450型SEM 觀察。

1.2.5 TEM 觀察 樣品在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min；10mL／L鋨酸再固定后，脫水，丙酮置換，環(huán)氧樹脂618包埋，切片機(jī)切片，日立H2600型TEM 觀察。

2 結(jié) 果

2.1 大體標(biāo)本觀察 實(shí)驗(yàn)組（截骨組、骨折組）與空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)中各組大鼠無意外死亡，截骨組術(shù)后3周髁突頭呈縮小趨勢(shì)，術(shù)后5、9周髁突變窄而高，呈現(xiàn)縮小趨勢(shì)。骨折組術(shù)后3、5、9周，髁突呈縮小趨勢(shì)，但縮小程度較截骨組小。

2.2 光鏡結(jié)果 髁突從外至內(nèi)分為纖維層、增殖層、成軟骨細(xì)胞層及肥大細(xì)胞層。術(shù)后3、5周，截骨組及骨折組總厚度均小于空白對(duì)照組，術(shù)后3周截骨組手術(shù)側(cè)更多的形成軟骨下骨組織。見圖1。

2.3 SEM 觀察結(jié)果 空白對(duì)照組髁突軟骨表面呈波紋狀結(jié)構(gòu)，上散布顆粒狀物質(zhì)。隨著鼠齡的增大，顆粒狀物質(zhì)減少，波紋狀結(jié)構(gòu)紊亂，但表面光滑，凝膠狀物質(zhì)覆蓋完整。骨折組術(shù)后1周，髁突軟骨表面波紋狀形態(tài)不明顯，顆粒狀物質(zhì)相比于同齡空白對(duì)照組減少。術(shù)后3周，表面波紋狀形態(tài)不明顯，少部分區(qū)域凝膠狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維暴露。術(shù)后5周，顆粒狀物質(zhì)消失，表面波紋狀形態(tài)不明顯，凝膠狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維暴露，但未出現(xiàn)纖維斷裂。截骨組術(shù)后1周，髁突軟骨表面波紋狀形態(tài)紊亂，顆粒狀物質(zhì)相比于空白對(duì)照組減少，凝膠狀物質(zhì)覆蓋完整。術(shù)后3周，大部分區(qū)域凝膠狀物質(zhì)消失，多處深層膠原纖維暴露。術(shù)后5周，顆粒狀物質(zhì)消失，深層膠原纖維廣泛暴露，并有纖維斷裂、崩解。見圖2。

2.4 TEM 觀察結(jié)果 骨折組術(shù)后3周，纖維層可見到裂隙及空泡樣變，膠原纖維斷裂。截骨組術(shù)后1周，纖維細(xì)胞層排列更為稀疏，表面纖維排列紊亂甚至缺失。術(shù)后3周，膠原排列紊亂，軟骨細(xì)胞較空白對(duì)照組成熟分化更為明顯。術(shù)后5周，膠原纖維排列更為紊亂，纖維層中可見到裂隙?？瞻讓?duì)照組在纖維層未見到裂隙及纖維排列紊亂。見圖3。

圖1 髁突軟骨的光鏡結(jié)果（×100）

圖2 髁突軟骨的SEM 觀察結(jié)果

圖3 髁突軟骨的TEM 觀察結(jié)果

3 討 論

髁突軟骨作為下頜骨重要的生長(zhǎng)區(qū)，在髁突與下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育中起著非常重要的作用。髁突軟骨與四肢生長(zhǎng)板軟骨不同，為纖維軟骨，成骨方式為軟骨內(nèi)成骨。在軟骨生長(zhǎng)發(fā)育過程中，關(guān)節(jié)軟骨在受到各種類型的應(yīng)力后，引起軟骨一系列的物理、化學(xué)變化，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞的生理活動(dòng)的變化。

正常的顳頜關(guān)節(jié)髁突表面覆蓋有一層厚約2μm 的凝膠樣物質(zhì)，此物質(zhì)來源于關(guān)節(jié)滑液，由滑膜B 細(xì)胞產(chǎn)生，被認(rèn)為是關(guān)節(jié)健康標(biāo)志。當(dāng)滑液的潤(rùn)滑功能被破壞或軟骨表層膠原纖維暴露時(shí)，關(guān)節(jié)內(nèi)摩擦系數(shù)將升高［9］，久之將會(huì)破壞關(guān)節(jié)健康。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠髁突頸部骨折及截骨的動(dòng)物模型模擬作用于髁突的異常應(yīng)力模型，SEM 觀察到髁突骨折及截骨組在術(shù)后3周均有膠原纖維暴露，截骨組在術(shù)后5周見到膠原纖維斷裂，且兩組均有凝膠樣物質(zhì)的消失。TEM 也觀察到術(shù)后3周，骨折組見膠原纖維斷裂，而截骨組術(shù)后5周，纖維層中可見到裂隙。在空白對(duì)照組中，纖維層未見到裂隙及纖維排列紊亂。SEM 及TEM 均觀察到膠原纖維排列紊亂或斷裂，與國(guó)內(nèi)一些學(xué)者觀察結(jié)果相似。傅開元等［10］通過建立牙合創(chuàng)傷的動(dòng)物模型，觀察到創(chuàng)傷組3、5個(gè)月組的髁突軟骨均可見明顯的退行性改變，最表面的覆蓋物脫落，膠原纖維排列松散、斷裂。黃洋等［11］建立偏側(cè)咀嚼動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)偏側(cè)咀嚼一段時(shí)間后髁突表面凝膠狀物質(zhì)不完整，膠原纖維松解、斷裂及暴露。一些學(xué)者認(rèn)為膠原纖維的暴露可能是軟骨變性的開始，而當(dāng)關(guān)節(jié)出現(xiàn)不平衡運(yùn)動(dòng)時(shí)，纖維可能松解、裂隙甚至斷裂［12］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，截骨組手術(shù)側(cè)纖維層出現(xiàn)裂隙及膠原斷裂可能與截骨導(dǎo)致應(yīng)力改變更為明顯有關(guān)。此外，膠原纖維松解斷裂，暴露于關(guān)節(jié)腔，軟骨內(nèi)蛋白多糖和膠原纖維等大分子進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，可能成為抗原而刺激機(jī)體引發(fā)局部的免疫反應(yīng)，使軟骨組織受到破壞。同時(shí)，隨著應(yīng)力的改變，術(shù)后3周截骨組手術(shù)側(cè)軟骨細(xì)胞成熟分化能力較空白對(duì)照組增強(qiáng)，更多的軟骨細(xì)胞加速鈣化形成骨組織，提示應(yīng)力變化影響軟骨細(xì)胞的成熟分化。Chen等［13］通過髁突軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，施加不同應(yīng)力，觀察到當(dāng)施加靜壓力90kPa 60min時(shí)，細(xì)胞體積變大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹。而當(dāng)施加時(shí)間為360min時(shí)，則出現(xiàn)凋亡小體。張旻等［14］也發(fā)現(xiàn)對(duì)髁突軟骨細(xì)胞施加90kPa的應(yīng)力6h后細(xì)胞部分出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡指征。此外，Sharawy等［15］建立兔關(guān)節(jié)盤前移位動(dòng)物模型，觀察到軟骨細(xì)胞凋亡增加及軟骨細(xì)胞基質(zhì)中膠原類型的改變，提示不同的應(yīng)力會(huì)影響軟骨細(xì)胞的凋亡及基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)中未見到明顯的凋亡小體，可能與觀察面積局限，而髁突軟骨細(xì)胞凋亡未廣泛分布所致。

以上研究表明異常的應(yīng)力作用于髁突軟骨，會(huì)引起軟骨表面膠原纖維結(jié)構(gòu)的改變，且隨應(yīng)力改變程度不同而不同，纖維結(jié)構(gòu)的變化使髁突表層容易受磨耗。同時(shí)手術(shù)側(cè)髁突軟骨細(xì)胞更多的成熟分化為骨組織，使軟骨細(xì)胞數(shù)目減少。單獨(dú)或二者聯(lián)合的結(jié)果使手術(shù)側(cè)髁突形狀變小。同時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，手術(shù)側(cè)髁突未觀察到明顯的修復(fù)發(fā)生，手術(shù)側(cè)髁突體積隨著時(shí)間未能恢復(fù)正常，提示在髁突的生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)，由骨折等外傷原因引起的異常應(yīng)力可能會(huì)對(duì)髁突的超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損害，影響髁突的形狀，進(jìn)而影響頜面部的形態(tài)及功能。此外，由于電鏡技術(shù)本身的限制，有關(guān)形態(tài)變化與髁突軟骨細(xì)胞功能的關(guān)聯(lián)有待于結(jié)合其他研究方法和手段進(jìn)一步深入研究。

［1］ 吳拓江，許躍，李煌，等.不對(duì)稱性頜間牽引作用下BMP2在成年SD 大鼠髁突關(guān)節(jié)下骨中的表達(dá)［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，36（3）：349-352.

［2］ 朱房勇，陳玉華，李國(guó)民，等.SD 大鼠單側(cè)髁突頸橫行截骨、骨折致下頜骨偏斜的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，（19）：2191-2193.

［3］ Hu Y，Yang HF，Li S，et al.Condyle and mandibular bone change after unilateral condylar neck fracture in growing rats［J］.Int J Oral Maxillofac Surg，2012，41（8）：912-921.

［4］ Gredes T，Mack H，Spassov A，et al.Changes in condylar cartilage after anterior mandibular displacement in juvenile pigs［J］.Arch Oral Biol，2012，57（6）：594-598.

［5］ Jahan E，Matsumoto A，Rafiq AM，et al.Fetal jaw movement affects Ihh signaling in mandibular condylar cartilage development：the possible role of Ihh as mechanotransduction mediator［J］.Arch Oral Biol，2014，59（10）：1108-1118.

［6］ Magara J，Nozawa-Inoue K，Suzuki A，et al.Alterations in intermediate filaments expression in disc cells from the rat temporomandibular joint following exposure to continuous compressive force［J］.J Anat，2012，220（6）：612-621.

［7］ Sobue T，Yeh WC，Chhibber A，et al.Murine TMJ loading causes increased proliferation and chondrocyte maturation［J］.J Dent Res，2011，90（4）：512-516.

［8］ Zhang M，Chen FM，Chen YJ，et al.Effect of mechanical pressure on the thickness and collagen synthesis of mandibular cartilage and the contributions of G proteins［J］.Mol Cell Biomech，2011，8（1）：43-60.

［9］ Tanaka E，Iwabe T，Dalla-Bona DA，et al.The effect of experimental cartilage damage and impairment and restoration of synovial lubrication on friction in the temporomandibular joint［J］.J Orofac Pain，2005，19（4）：331-336.

［10］ 傅開元，馬緒臣，張震康，等.創(chuàng)傷致家兔顳下頜關(guān)節(jié)滑膜和軟骨超微結(jié)構(gòu)的改變［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1998，33（1）：18-20.

［11］ 黃洋，陳遠(yuǎn)萍，倪雪巖，等.偏側(cè)咀嚼大鼠髁突組織學(xué)及嚼肌超微結(jié)構(gòu)的研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2003，19（4）：277-279.

［12］ 韓傳火，李金榮，趙怡芳.髁狀突軟骨纖維組織的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2003，19（5）：368-370.

［13］ Chen YJ，Zhang M，Wang JJ.Study on the effects of mechanical pressure to the ultrastructure and secretion ability of mandibular condylar chondrocytes［J］.Arch Oral Biol，2007，52（2）：173-181.

［14］ 張旻，王美青，王景杰.壓力對(duì)髁突軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及可聚蛋白多糖分泌的影響［J］.醫(yī)用生物力學(xué)，2004，19（2）：69-73.

［15］ Sharawy M，Ali AM，Choi WS，et al.Ultrastructural characterization of the rabbit mandibular condyle following experimental induction of anterior disk displacement［J］.Cells Tissues Organs，2000，167（1）：38-48.