趙　峰　趙彥芬　毛　軻(河南省中醫(yī)院麻醉科，河南　鄭州　450002)

蛛網膜下腔出血后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經細胞凋亡

趙峰趙彥芬毛軻
(河南省中醫(yī)院麻醉科，河南鄭州450002)

〔摘要〕目的探討蛛網膜下腔出血(SAH)后小鼠早期腦損傷海馬區(qū)神經細胞凋亡的變化。方法90只小鼠隨機分為正常組12只、SAH 組48只和假手術組30只; SAH組與假手術組再隨機分為6、12、24、48 h和3、7 d 6個亞組。應用枕大池內的自體動脈血二次注入法構建起大鼠SAH模型，應用免疫組織化學法檢測3組海馬區(qū)神經元內的caspase-3及bcl-2的表達。結果SAH組凋亡分子caspase-3和抗凋亡分子bcl-2的mRNA都不同程度地升高，caspase-3隨著時間的不斷延長而隨之增多，在24 h后這種增多更明顯，48 h后達高峰，24 h至7 d各時間段和假手術組、正常組相比差異顯著(P＜0.05)。正常組與假手術組在海馬區(qū)內的表達量各時間點差異不明顯(P＞0.05)。Bcl-2在SAH后12 h變化最明顯，Bcl-2表達量各時間點與假手術組、正常組差異明顯(P＜0.05)。結論SAH后早期腦損傷海馬區(qū)神經細胞凋亡，凋亡及抗凋亡途徑均在下丘腦內起作用。

〔關鍵詞〕腦損傷;凋亡;神經細胞

第一作者:趙峰(1970-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉研究。

蛛網膜下腔出血(SAH)占急性腦卒中的10％左右〔1〕。據世界衛(wèi)生組織調查結果表明，我國SAH發(fā)病率約為2.0/10萬人年，也有學者調查認為是每年(6～20) /10萬人〔2〕。另外，患者由于腦實質內，腦室出血，硬膜外及硬膜下血管破裂，進而導致血液穿破腦組織流入蛛網膜下腔，而引發(fā)的臨床綜合征，稱之為繼發(fā)性SAH。SAH典型臨床表現(xiàn)為突然發(fā)生的劇烈頭痛、惡心、嘔吐和腦膜刺激征，伴或不伴局灶體征。劇烈活動中或活動后出現(xiàn)爆裂性局限性或全頭部劇痛，難以忍受，呈持續(xù)性或持續(xù)進行性加重，有時上頸段也可出現(xiàn)疼痛。其始發(fā)部位常與動脈瘤破裂部位有關。常見伴隨癥狀有嘔吐、短暫意識障礙、項背部疼痛、畏光等。本實驗分析SAH小鼠海馬組織caspase-3和Bcl-2水平和早期腦損傷關系。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組90只健康成年雄性小鼠，體質量25～30 g，均由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分為SAH組48只，假手術組30只，正常組12只，其中SAH組和假手術組分為6、12、24、48 h、3、7 d，共6個亞組，SAH亞組各8只。而假手術組每亞組5只。

1.2儀器和試劑石蠟包埋機(BMJ-III，中國，常州) ; 301-268型轉輪式組織切片機Leica公司，德國;奧林巴斯生物顯微鏡BHS型，日本; SP9001免疫組化試劑盒;多克隆抗體〔(北京中杉金橋生物技術有限公司(分裝SantaCruz公司)〕;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，免疫組織化學檢測試劑盒及3-二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(由北京中杉金橋公司提供)。

1.3SAH模型制作采用10％水合氯醛(規(guī)格為300 mg/kg)經腹腔注射麻醉后取仰臥位，將其固定在立體定向儀上，剪開腹部皮膚，將帶0.5 ml注射器的套管針插入左心室直達主動脈，抽取新鮮的動脈血，同時使用止血鉗牢牢夾緊，給予結扎止血處理，完成后再進行逐層縫合;然后取俯臥位，將其牢牢固定在腦立體定位儀，沿著頸背部中線直至切開皮膚皮下，用無菌光滑鈍頭針頭刺破顱骨后，將0.3 ml左右新鮮動脈血緩慢注入蛛網膜下腔，頭置低位使血液擴散，10 min后拔除針頭，封閉骨孔，縫合切口。假手術組除向枕大池內注射0.9％氯化鈉注射液0.3 ml，其余處理與上述方法相同。

1.4海馬組織的提取及固定麻醉消毒后，SAH后不同時間段取仰臥位固定后慢慢剪開腹部皮膚，提起劍突，同時沿著胸骨左側方向剪開肋骨，暴露出心臟部位，用無菌生理鹽水(37℃)、4％多聚甲醛進行心臟灌注，先快后慢，灌注總量為400 ml左右。小鼠斷頭后在顯微鏡下取出腦組織迅速取出，根據鼠腦定位，仔細分離出海馬組織后，置于4％多聚甲醛中固定，4℃過夜。石蠟包埋，修塊，切片。

1.5神經功能檢測評分記錄各SAH組24 h死亡率，存活小鼠在實驗完成后24 h根據Bederson〔3〕標準的相關內容來實施神經行為功能缺損評分，具體的標準主要包括:提鼠尾距離地面33 cm(1尺)左右處，如果前肢對稱伸向地面，可判定為0分;手術對側肩內旋，同時前肢發(fā)生內收，1分;手術對側肩內旋，同時可見前肢內收，推動雙肩過程中手術對側的抵抗力開始出現(xiàn)下降，2分;手術對側肩發(fā)生內旋，同時前肢出現(xiàn)內收;在推動雙肩的過程中發(fā)現(xiàn)手術對側的抵抗力開始下降;在空曠的平面上，小鼠開始進行繞圈行走，3分;前肢發(fā)生內收;推動雙肩過程中手術對側的抵抗力開始發(fā)生下降;沒有出現(xiàn)任何自主活動，4分。

1.6統(tǒng)計學方法應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗。

2　結果

2.1各SAH組24 h死亡率和神經行為功能缺損情況SAH組后24 h，有少數(shù)動物(神經功能缺損評分4分14只，3分和2分各12只，1分6只，0分4只)出現(xiàn)神經功能障礙，表現(xiàn)為運動減少、反應淡漠和拒絕進食(P＜0.05)。對照組和假手術組無明顯神經行為異常表現(xiàn)。

2.23組海馬區(qū)caspase-3表達水平SAH組海馬區(qū)內caspase-3隨著時間的不斷延長而增多，24 h后其表達量的增多明顯，48 h后達高峰，24 h至7 d各時間段和假手術組、正常組差異顯著(P＜0.05)。正常組與假手術組海馬區(qū)內的caspase-3各時間點差異不顯著(P＞0.05)。見表1。SAH組caspase-3陽性顯示細胞呈棕黃色，見圖1。

表1　各組caspase-3海馬區(qū)不同時間段平均光密度(±s)

表1　各組caspase-3海馬區(qū)不同時間段平均光密度(±s)

與SAH組比較: 1) P＜0.05;與6、12 h比較: 2) P＜005;下表同

組別　n　6 h　12 h　24 h　48 h　3 d　7 d正常組　12　 0.002 4±0.001 8　 0.002 4±0.001 8　 0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81)　0.002 4±0.001 81)0.002 4±0.001 81)假手術組　30　 0.002 2±0.001 1　 0.002 3±0.001 7　 0.002 6±0.001 31)0.002 7±0.001 01)　0.002 4±0.001 21)0.002 5±0.001 41)SAH組　48　 0.003 0±0.003 2　 0.003 3±0.004 2　 0.007 2±0.005 32)　0.009 0±0.005 12)　0.008 4±0.004 72)　0.007 8±0.003 62)

圖1　正常組和SAH組海馬區(qū)caspase-3陽性表達(×1 000)

2.33組Bcl-2蛋白表達SAH組12 h明顯升高，第2天時達到最高峰，直到第7天一直處于高水平。24 h至7 d各時間段和假手術組及正常組差異顯著(P＜0.05)。正常組和假手術組海馬區(qū)Bcl-2表達量各時間點差異不顯著(P＞0.05)。見表2。SAH組Bcl-2陽性染色位于細胞質內，胞質內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。見圖2。

2.4SAH組2 d caspase-3及Bcl-2蛋白表達變化SAH組第2 天caspase-3及Bcl-2蛋白和假手術組比較，表現(xiàn)出了不同程度的升高現(xiàn)象。見圖3。

表2　各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(±s)

表2　各組Bcl-2蛋白海馬區(qū)表達(±s)

組別　n　6 h　12 h　24 h　48 h　3 d　7 d正常組　12　 49.23±5.43　49.45±5.34　49.42±5.161)　49.26±5.751)　49.36±5.761)　49.41±5.521)假手術組　30　 51.64±6.14　49.09±5.57　 51.57±6.491)　50.35±7.161)　51.85±7.121)　50.36±5.221)SAH組　48　 51.53±5.38　62.68±4.92　65.74±3.95　69.23±2.15　64.45±3.93　63.79±1.36

圖2　正常組和SAH組海馬區(qū)Bcl-2蛋白表達(×1 000)

圖3　SAH組48 h caspase-3和Bcl-2蛋白的變化

3　討論

SAH最重要危險因素主要來自于導致顱內動脈瘤破裂的因素，包括高血壓、吸煙、大量飲酒、既往有動脈瘤破裂病史、動脈瘤體積較大、多發(fā)性動脈瘤等〔4～6〕。與不吸煙者相比，吸煙者的動脈瘤體積更大，且更常出現(xiàn)多發(fā)性動脈瘤。任何年齡均可發(fā)病，青壯年更常見，動脈瘤破裂好發(fā)于30～60歲，女性多于男性，血管畸形多見于青少年〔7，8〕。SAH突然起病，數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘發(fā)生頭痛是最常見的起病方式?；颊叱Ｄ芮宄孛枋銎鸩〉臅r間和情景。發(fā)病前多有明顯誘因，主要包括肢體劇烈運動或者情緒激動、用力較大等生理或者心理活動，其他還有咳嗽、飲酒等;部分情況下也可在安靜情況下發(fā)病〔9～11〕。約1/3患者動脈瘤破裂前數(shù)日或數(shù)周有頭痛、惡心、嘔吐等癥狀〔12～14〕。確診SAH之后，應盡早行腦血管造影或CT血管成像(CTA)檢查，一旦證實為顱內動脈瘤破裂，盡快準備實施開顱夾閉手術或血管內介入栓塞治療。SAH治療目的主要是防治再出血、血管痙攣及腦積水等并發(fā)癥，降低死亡率和致殘率。

細胞凋亡具有復雜的分子調控機制，多種基因被證實在早期腦損傷和遲發(fā)性血管痙攣血管壁組織中參與凋亡的發(fā)生〔15，16〕，其中包括P53、Bcl-2及Caspases等。Bcl-2則被認為是抑制和促進細胞凋亡的最重要基因〔17～19〕，Bcl-2首次提出是在1984年，從濾泡性淋巴細胞瘤中分離得到的癌基因，研究顯示〔20〕，Bcl-2基因對腦損傷后機體神經細胞的生存發(fā)揮積極作用，應用價值較高。caspase-3是現(xiàn)階段學界一致認可的細胞凋亡過程中的關鍵酶，屬于機體多種凋亡刺激信號傳遞的一個重要匯聚點，也是細胞凋亡時的一個必經之路，因而臨床上普遍將其當作凋亡發(fā)生的一種標志酶〔21，22〕。

綜上，SAH后存在著早期腦損傷問題，同時細胞凋亡也是導致早期腦損傷發(fā)生并進一步發(fā)展的關鍵因素之一，不排除與神經元凋亡有關，同時也可能存在其他細胞的凋亡。

4　參考文獻

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〔2014-07-09修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R741.02

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4491-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.031