李　鋒　聶喜增　劉金輝　關(guān)　健　王華軍(石家莊市第三醫(yī)院，河北　石家莊　050000)

胰島素樣生長因子-1及轉(zhuǎn)化生長因子-β2對幼年及成年兔軟骨細胞合成糖胺多糖的影響

李鋒聶喜增劉金輝關(guān)健王華軍
(石家莊市第三醫(yī)院，河北石家莊050000)

〔摘要〕目的觀察胰島素樣生長因子(IGF) -1及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) -β2對體外培養(yǎng)的幼年及成年兔軟骨細胞合成糖胺多糖的影響。方法取2月齡幼年及12月齡成年雄性新西蘭大白兔，采用酶消化法取兔軟骨細胞并培養(yǎng)于第2代軟骨細胞，隨機分為四組進行培養(yǎng)，分別為空白對照組; IGF-1組; TGF-β2組; IGF-1+TGF-β2組。每周傳代1次，連續(xù)5 w，用Alcian blue法分別測定留取培養(yǎng)液中GAG的含量;利用光鏡觀察原代及傳代軟骨細胞的生長情況，比較各組的變化。結(jié)果幼年組GAG的分泌能力優(yōu)于成年組;第二代傳代細胞分泌GAG的能力最強; IGF-1及TGF-β2均可促進傳代軟骨細胞合成大量的糖胺多糖類基質(zhì)，IGF1+TGF-β2組明顯優(yōu)于其他組(P＜0.05)。結(jié)論外源性IGF-I和TGF-β2可促進不同年齡兔關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖和GAG的分泌，聯(lián)合應用發(fā)揮協(xié)同作用，提示外源性生長因子可抑制軟骨細胞在體外培養(yǎng)的老化過程。

〔關(guān)鍵詞〕骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細胞;組織工程;轉(zhuǎn)化生長因子-β2;胰島素樣生長因子-1;糖胺多糖

第一作者:李鋒(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)外科的臨床與基礎(chǔ)研究。

外傷和疾病引起的軟骨損傷和缺損是臨床常見疾患，常常導致受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、積液、疼痛及交鎖等功能障礙，但由于關(guān)節(jié)軟骨自身修復能力極其有限，因此造成軟骨的永久性損傷，嚴重影響患者的關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量〔1〕。以往的治療方法如軟骨鉆孔術(shù)、自體或異體軟骨組織移植術(shù)等有較大的困難及局限性。近年來隨著生物醫(yī)學工程的發(fā)展，組織工程概念被引入到軟骨缺損的治療中。在軟骨組織發(fā)育生長過程中細胞因子起到了重要的調(diào)控作用〔1～3〕，其中胰島素樣生長因子(IGF) -1及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) -β2能夠促進軟骨細胞增殖、維持軟骨細胞穩(wěn)定性和促進軟骨細胞持續(xù)分泌軟骨相關(guān)基質(zhì)。糖胺多糖(GAG)是軟骨的主要組成之一，軟骨細胞合成GAG能力是反映其分化的重要指標〔2～4〕。本研究探討IGF-1和TGF-β2對體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖和合成GAG能力的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑選取雄性新西蘭大白兔10只，分為幼年兔組(2月齡，約1.8 kg)和成年兔組(12月齡，約3.5 kg)。IGF-1、TGF-β2、胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶(均購自Sigma公司)，胎牛血清購于中國醫(yī)學科學院血液學研究所，CO2培養(yǎng)箱購于北京醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2軟骨細胞的分離培養(yǎng)與傳代使用空氣栓塞法處死動物，在無菌條件下將兩組動物的膝關(guān)節(jié)游離并用骨剪截取，用生理鹽水充分漂洗，充分刮除關(guān)節(jié)周圍附著的組織如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，后使用D-Hank液充分漂洗。用刀片削取關(guān)節(jié)表面的軟骨，充分漂洗軟骨小塊，用眼科剪剪碎至1 mm3，用小刮匙把軟骨小塊轉(zhuǎn)移至小錐形瓶中。加入適量Ⅱ型膠原酶，37℃消化4 h，每1 h吹打1次，成混懸液。分別接種到25 ml的培養(yǎng)瓶，5％ CO2，37℃培養(yǎng)，每2天換液1次，細胞融合80％后傳代擴增以備用。分別選擇幼年及成年兔第二代軟骨細胞各自分為四組:只加DMEM作為空白對照;加含IGF-1 (50 ng/ml)的DMEM為IGF-1組; TGF-β2組加含TGF-β2 (10 ng/ml)的DMEM; IGF-1+TGFβ2組加含IGF-1(50 ng/ml)、TGF-β2(10 ng/ml)的DMEM。

1.3觀測指標

1.3.1軟骨細胞形態(tài)和生長情況取第2代軟骨細胞，用0.1％胰酶消化，吹打成細胞懸液，1 200 r/min離心，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，連續(xù)傳5代。隔日倒置顯微鏡觀察兩組細胞形態(tài)和增殖情況。

1.3.2GAG的檢測采用Alcian blue染色沉淀法測定。培養(yǎng)液上清由－20℃冰箱中取出，置于4℃冰箱中解凍。取標準品和樣本各100 μl加入不同的1.5 ml eppendorf離心管中，分別加入8 mol/L鹽酸胍50 μl，搖勻后再分別加入50 μl試劑，搖勻靜置10 min，各加入650 μl冰凍試劑過夜。將過夜的溶液在12 000 r/min的條件下離心15 min，各取700 μl上清液分別移入新1.5 ml離心管，各加入500 μl Alcian blue染液，搖勻后靜置至少1 h，然后再在同樣條件下離心15 min，棄去上清液，分別加入750 μl DMSO洗液，震蕩0.5 h，同樣條件下離心15 min，棄去上清液，再分別加入500 μl分散液，震蕩15 min后，在600 nm波長下用酶標儀測定GAG含量。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS15.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗和方差分析進行組間比較。

2　結(jié)果

2.1細胞形態(tài)的觀察剛分離收獲的幼年兔及成年兔關(guān)節(jié)軟骨細胞呈球形懸浮在培養(yǎng)液中，有較強折光性。培養(yǎng)24 h后細胞開始貼壁，細胞逐漸變?yōu)橥该鲌A盤狀。培養(yǎng)48 h后細胞基本貼壁固定，少量鋪展，形態(tài)由圓盤狀逐漸向外伸出突起而成多角形，少數(shù)呈梭形。隨著細胞數(shù)量增加體積增大，細胞形態(tài)趨于一致。3～4 d后集落逐漸形成，其中集落周邊細胞較中心瘦長，為長多邊形。培養(yǎng)1 w后細胞逐漸融合，排列緊密，呈“鋪路石”樣外觀。

2.2GAG含量的檢測結(jié)果幼年及成年兔各組GAG含量比較，第3周IGF-1+TGF-β2組GAG含量最多，其次是TGF-β2組及IGF-1組，最少的是對照組，見表1，表2。

表1　幼年兔各組GAG含量(±s，ng/ml)

表1　幼年兔各組GAG含量(±s，ng/ml)

分組　1 w　2 w　3 w　4 w　5 w對照組　10.21±1.93　13.10±2.36　16.01±2.26　15.12±2.74　13.02±2.33 IGF-1組　12.26±2.03　16.82±2.43　20.25±2.75　18.53±2.26　15.18±2.56 TGF-β2組　13.24±2.12　17.37±2.66　21.85±2.77　19.54±2.35　16.51±2.74 IGF-1+TGF-β2組　15.64±3.64　20.81±3.86　29.78±3.34　22.71±3.16　19.36±2.75

表2　成年兔各組GAG含量(±s，ng/ml)

表2　成年兔各組GAG含量(±s，ng/ml)

分組　1 w　2 w　3 w　4 w　5 w對照組　9.13±1.76　11.26±1.91　15.32±2.37　14.85±2.26　11.25±2.57 IGF-1組　10.15±2.12　15.43±2.46　18.58±2.43　16.69±2.17　13.27±2.83 TGF-β2組　11.76±2.51　16.61±2.73　19.16±2.57　17.34±2.36　14.11±2.39 IGF-1+TGF-β2組　13.34±2.91　18.73±3.02　27.37±3.83　20.56±3.71　17.52±2.69

3　討論

軟骨是構(gòu)成人體的重要組成部分，主要由軟骨細胞、纖維結(jié)締組織和細胞外基質(zhì)組成。GAG與軸心蛋白、透明質(zhì)酸支架形成的蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)的主要成分。GAG可與水分子結(jié)合，具有膨脹壓力，使軟骨富有彈性，從而起到維持軟骨承重能力的作用〔1，2〕。GAG由軟骨細胞合成分泌，因此合成GAG的能力是反映軟骨細胞分化的重要指標。由于軟骨不含神經(jīng)、血管和淋巴管，供應軟骨的營養(yǎng)物質(zhì)通過軟骨外血液和淋巴液滲透進入軟骨基質(zhì)，營養(yǎng)軟骨細胞。因此，極小的軟骨損傷就不能完全恢復。目前臨床上常用的自體及異體軟骨移植、微骨折及病區(qū)剝削等方法整復軟骨缺損，但是都具有一些缺點，如供體組織數(shù)量有限、異體移植的免疫排斥反應、新生組織無法恢復軟骨的原有承重、耐磨以及高彈性模量、不能耐受足夠的壓力以及組織退變等〔2～4〕。

以往的研究已經(jīng)證實細胞生長因子在軟骨細胞的生長和分化起著促進作用，已成為軟骨組織工程研究中的熱點之一〔3～6〕，具有調(diào)理代謝、促進有絲分裂和成熟分化的生理功能，主要作用是刺激骨、軟骨細胞的生長和分化;調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。生長因子不僅參與軟骨細胞的增殖、分化和基質(zhì)代謝活動，同時作為信號物質(zhì)參與軟骨修復的調(diào)節(jié)。在關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療過程中，尤其對于僅有局限軟骨缺損的關(guān)節(jié)，可以刺激關(guān)節(jié)面的恢復，促進新關(guān)節(jié)面的形成。若將生長因子連同細胞移植，對治療單純軟骨和年輕人的早期軟骨退化效果更為顯著〔5～8〕。在眾多的生長因子中，TGF-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、TGF-1及成纖維細胞生長因子能延緩體外培養(yǎng)細胞的老化和去分化，促進軟骨細胞增殖、分化。IGF-1則是軟骨代謝和維持軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的最關(guān)鍵的生長因子之一，具有刺激軟骨細胞集落形成和分裂增殖、促進軟骨細胞集落和結(jié)節(jié)形成的作用;可保持軟骨細胞活性，促進其逆分化，促進成熟軟骨細胞DNA合成和細胞增殖加速，細胞外基質(zhì)分泌，增加軟骨組織膠原和前列腺素合成等作用;阻止軟骨基質(zhì)中金屬蛋白酶的表達，從而起到抑制蛋白多糖退變的作用;刺激Ⅱ型膠原及聚胺多糖的合成，穩(wěn)定體外培養(yǎng)軟骨細胞的軟骨表型〔9，10〕。

TGF-β2又稱為軟骨因子B，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。在軟骨組織的生長發(fā)育以及再生與修復等生理病理過程中起重要作用，是參與組織工程療法治療軟骨疾患的重要細胞因子〔7～10〕。以往的研究證實TGF-β2能夠誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化，促進軟骨細胞分泌軟骨相關(guān)基質(zhì)Ⅱ型膠原及蛋白多糖。TGF-β2還具有雙向調(diào)節(jié)作用，促進分化早期或者未分化的軟骨細胞增殖分化和合成軟骨相關(guān)基質(zhì)，對于分化末期的軟骨細胞，則往往抑制軟骨細胞外基質(zhì)鈣化和堿性磷酸酶活性，減緩其分化速度。此外，TGF-β亞型mRNA及相關(guān)受體在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中表達與損傷程度呈正比，并介導肌腱-骨愈合反應，TGF-β2還可以調(diào)節(jié)其他細胞因子如IGF、骨形成蛋白及纖維母細胞生長因子，并共同參與軟骨細胞生長分化，因此可以聯(lián)合應用TGF-β2及其他激活物共同誘導軟骨分化。在本研究中證實IGF-1與TGF-β2單獨及聯(lián)合應用可以維持細胞表型，促進GAG分泌，二者聯(lián)合使用對軟骨細胞產(chǎn)生協(xié)同作用。其聯(lián)合應用能顯著促進軟骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生，較單獨使用效果更佳，證明二者在促進軟骨組織形成中具有協(xié)同作用。軟骨組織形成過程是由多種細胞因子共同操控和影響的，而單一細胞因子的作用往往具有局限性，隨著對各種因子之間的相互作用的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種細胞因子在關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出協(xié)同作用〔11，12〕。這些研究表明一種細胞因子不僅調(diào)控本身或其他細胞因子的受體表達，還可以調(diào)節(jié)另一種細胞因子的合成和分泌，從而通過不同的信號傳導途徑傳入細胞內(nèi)，經(jīng)過幾條信號傳導途徑的綜合放大，從而產(chǎn)生更強的刺激作用〔7～11〕。

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〔2015-01-05修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:王華軍(1982-)，男，博士，主要從事關(guān)節(jié)外科的臨床與基礎(chǔ)研究。

基金項目:石家莊市科學技術(shù)研究與發(fā)展指導計劃(No．04146973)

〔中圖分類號〕R68

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4458-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.017