唐漢慶　鄭建宇　竇錫彬　李克明　趙玉峰　李曉華　舒方義　廉春容　楊園園(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西　百色　533000)

壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合針挑療法對(duì)大鼠抗氧化損傷與衰老的影響

唐漢慶鄭建宇竇錫彬李克明趙玉峰李曉華舒方義廉春容楊園園
(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000)

〔摘要〕目的探討壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合針挑療法抗氧化損傷與衰老的效果。方法SPF級(jí)Wistar大鼠100只隨機(jī)分為正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)、模型組、藥線組、針挑組及藥線+針挑組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)，每組20只。藥線組、針挑組、聯(lián)合組分別給予藥線點(diǎn)灸、針挑和藥線點(diǎn)灸、針挑聯(lián)合應(yīng)用治療。對(duì)照組、模型組不予特殊處理。連續(xù)3個(gè)療程。檢測(cè)活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)、腦脂褐素(LF)活性或水平變化及形態(tài)學(xué)觀察端粒酶表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組ROS、MDA和LF水平升高或顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性均顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，聯(lián)合組SOD、GSH-Px活性升高最顯著(P＜0.01) ; ROS水平、MDA水平和LF水平均下降或顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。與對(duì)照組比較，模型組端粒酶表達(dá)密度減少，表達(dá)活性降低。與模型組比較，藥線組和針挑組端粒酶表達(dá)密度增強(qiáng)，表達(dá)活性上升;而聯(lián)合組端粒酶表達(dá)密度顯著增強(qiáng)，表達(dá)活性顯著上升。結(jié)論壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸聯(lián)合針挑療法可增強(qiáng)抗氧化酶活性和端粒酶表達(dá)，提高抗氧化能力，可能是其抗衰老的機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸;壯醫(yī)針挑;抗氧化;抗衰老

第一作者:唐漢慶(1976-)，男，副教授，博士，主要從事民族醫(yī)藥與中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

The effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture

TANG Han-Qing，ZHENG Jian-Yu，DOU Xi-Bin，et al.
Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．Methods One hundred Wistar mice，SPF grade，were divided randomly into control，model，medical thread，acupuncture，combined groups with twenty mice in each group．Medical thread，acupuncture，combined groups were respectively treated with Zhuang medical thread moxibustion，Zhuang acupuncture and Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．The levels of ROS，MDA，LF(lipofusin)，activity of SOD，GSH-Px were tested and morphologic changes of telomerase were observed．Results Compared to those of control group，the levels of ROS，MDA，LF were increased in model group (P＜0．05 or P＜0．01)，the activities of SOD，GSH-Px were decreased significantly (P＜0．01)．Compared to those of model group，the activities of SOD and GSH-Px were increased significantly in combined group (P＜0．01) while the levels of ROS，MDA，LF were reduced(P＜0．05 or P＜0．01)．Compared to those of control group，the expression density and activity of telomerase were reduced in model group．Compared to those of model group，the expression density and activity of telomerase were increased in medical thread and acupuncture groups and they were increased obviously in combined group．Conclusions Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture could enhance activity of antioxidant enzyme and expression of telomerase and improve ability of antioxidation，which might be one of anti-aging mechanisms．

【Key words】Zhuang medical thread moxibustion; Zhuang acupuncture; Antioxidation; Anti-aging

壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸和針挑療法均是壯醫(yī)的特色醫(yī)技療法。藥線點(diǎn)灸療法已經(jīng)被實(shí)踐證明對(duì)慢性疼痛、老年病、失眠、哮喘、風(fēng)濕病等許多慢性病、疑難雜癥有良好的療效，具有科學(xué)性、創(chuàng)新性、實(shí)用性〔1〕。壯醫(yī)針挑療法也是壯醫(yī)的特色醫(yī)技療法，對(duì)哮喘、失眠、腰痛、甲亢、皮膚病、風(fēng)濕痛等適宜病癥療效較好，也有不少的報(bào)道〔2〕。對(duì)這兩種技法的臨床治療報(bào)道較多，近來(lái)對(duì)兩種技法在延緩衰老、養(yǎng)生保健方面的研究也引起重視，研究表明抗衰老和抗氧化作用是相互聯(lián)系的，與體內(nèi)自由基增多及端粒酶表達(dá)的變化有關(guān)〔3，4〕。本研究觀察壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸和針挑療法對(duì)衰老大鼠的抗氧化和抗衰老作用并討論其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)Wistar大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(173.18±7.65) g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(京) 2013-0004。動(dòng)物在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫控制在(23±1)℃范圍內(nèi)，相對(duì)濕度65％～70％，大鼠以基礎(chǔ)飼料常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)數(shù)字表法分為5組:正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)、模型組、藥線組、針挑組及藥線+針挑組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)。每組20只。所有實(shí)驗(yàn)大鼠的使用和喂養(yǎng)遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》(2006)相關(guān)條款。

1.2主要試劑和儀器D-半乳糖(北京化學(xué)試劑公司，批號(hào): 20110625)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)2013X0115)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px，批號(hào)20130206)、丙二醛(MDA，批號(hào)201302032)、活性氧(ROS，批號(hào)201306002)、腦脂褐素(LF，批號(hào)20131003)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司提供) ;兔抗端粒酶多克隆抗體(Sigma，USA)、羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(Z360K型，德國(guó)HERMLE公司)、電子天平(AE160型，瑞士Mettler公司)、分光光度計(jì)(722型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)、熒光分光光度計(jì)(F-3000型，日本日立)、電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(DY-89型，寧波新芝公司)、酶標(biāo)儀(MK3型，Thermo Labsystem公司)、電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(jī)(KD-2258-VI，浙江科迪)、熒光顯微鏡(Olympus IX51，日本)和倒置式生物顯微鏡(DMIL LED，德國(guó)萊卡)。

1.3造模方法及分組處理采用D-半乳糖腹腔注射造模，造模后分為模型組、藥線組、針挑組采用聯(lián)合組，余下為對(duì)照組。

藥線組:取雙側(cè)足三里穴位(ST36)，拇指和食指手持中號(hào)壯醫(yī)藥線(藥線直徑為0.7 mm)在酒精燈或蠟燭上點(diǎn)燃后，熄滅藥線明火火焰，此時(shí)藥線剩下圓珠狀炭火星，順應(yīng)手腕和拇指的屈曲動(dòng)作，拇指指腹穩(wěn)重而敏捷地將有圓珠狀炭火星線頭直接點(diǎn)壓于足三里穴位上，火滅即起稱為1壯，每穴每次共灸3壯。每天每穴點(diǎn)灸1次。7 d為1個(gè)療程，間隔1 d繼續(xù)下個(gè)療程。

針挑組:取雙側(cè)陽(yáng)陵泉(GB34)、環(huán)跳(GB30)穴位。穴位皮膚常規(guī)消毒，采用消毒大號(hào)縫衣針將上述穴位作為針挑點(diǎn)，用拇指、食指、中指合攏把針握緊，挑出皮下一些白色纖維組織，然后用針在該穴位垂直快速點(diǎn)刺3次，刺入皮下1 mm，點(diǎn)刺后以5％碘酒、75％酒精消毒，每天每穴位挑刺1次。7 d為1個(gè)療程，間隔1天繼續(xù)下個(gè)療程。

聯(lián)合組:聯(lián)合采用上述藥線組和針刺組的操作方法。藥線組、針挑組、聯(lián)合組均進(jìn)行連續(xù)3個(gè)療程的處理。模型組和對(duì)照組不作特殊處理。

1.4指標(biāo)檢測(cè)療程結(jié)束后處死大鼠。取靜脈血2 ml，離心(4℃，1 000 r/min，10 min)，分離血清，－70℃凍存。采用比色法測(cè)定血清ROS活性，二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH -Px活性，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清SOD活性;硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。另取大鼠腦組織液氮中凍存，檢測(cè)前用生理鹽水制備成10％勻漿，離心(4℃，3 000 r/min，15 min)，取上清熒光法測(cè)定LF含量。均嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.5端粒酶表達(dá)形態(tài)觀察免疫組化法檢測(cè)，大鼠腦組織置于電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(jī)，進(jìn)行連續(xù)切片，片厚10 μm，PBS泡洗30 min，干燥后進(jìn)行端粒酶免疫組化染片，加入兔抗端粒酶多克隆抗體室溫避光孵育10 h，洗去一抗，加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG孵育3 h，洗去二抗，DAB顯色試劑盒顯色，干燥，封片，顯微鏡下觀察并拍攝。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較用LSD檢驗(yàn)方法。

2　結(jié)果

2.1SOD活性檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組〔(193.28±16.78) U/ml〕比較，模型組SOD活性〔(90.14±6.88) U/ml〕顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，藥線組〔(141.21±10.02) U/ml〕和針挑組〔(156.78±12.84) U/ml〕SOD活性上升(P＜0.05) ;而聯(lián)合組SOD活性〔(189.98±18.26) U/ml〕顯著上升，接近對(duì)照組水平，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.2GSH-Px活性檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組〔(104.28± 8.83) U/ml〕比較，模型組〔(30.29±3.84) U/ml〕GSH-Px活性顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，藥線組〔(52.31± 4.12) U/ml〕GSH-Px活性有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) ;與模型組比較，針挑組GSH-Px活性〔(82.33±5.02) U/ml〕上升(P＜0.05) ;而聯(lián)合組GSH-Px活性〔(95.29±8.39) U/ml〕顯著上升，趨近對(duì)照組水平，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.3端粒酶表達(dá)形態(tài)觀察與對(duì)照組比較，模型組端粒酶表達(dá)密度減少，表達(dá)活性降低。與模型組比較，藥線組和針挑組端粒酶表達(dá)密度增強(qiáng)，表達(dá)活性上升;而聯(lián)合組端粒酶表達(dá)密度顯著增強(qiáng)，表達(dá)活性顯著上升，見(jiàn)圖1。

圖1　各組端粒酶表達(dá)形態(tài)比較(IHC，×40)

2.4ROS、MDA和LF檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組ROS、MDA和LF水平升高或顯著升高(P＜0.05或P＜0.01) ;與模型組比較，藥線組ROS、MDA和LF水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) ;針挑組ROS、MDA和LF水平下降(P＜0.05) ;聯(lián)合組ROS、MDA和LF水平下降或顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1　各組ROS、MDA和LF水平比較(±s)

表1　各組ROS、MDA和LF水平比較(±s)

與對(duì)照組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

組別　n　 ROS(ng/L)　 MDA(mol/L)　 LF(μg/g)對(duì)照組　20　 23.56±6.01　 5.78±1.46　 54.24±7.45模型組　20　 56.34±8.962)　21.45±2.162)　70.01±8.091)藥線組　20　 32.22±5.23　 16.02±1.74　 63.29±8.55針挑組　20　 29.24±5.863)　7.98±1.873)　53.02±7.853)聯(lián)合組　20　 21.04±5.164)　5.64±1.154)　51.22±7.813)

3　討論

D-半乳糖經(jīng)過(guò)半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過(guò)氧化氫，使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的ROS和超氧自由基，超氧自由基具有顯著增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用〔5〕，而脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物MDA通過(guò)交聯(lián)蛋白和DNA誘導(dǎo)LF的大量生成，反過(guò)來(lái)又加重過(guò)氧化損傷〔6，7〕，氧化損傷可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞功能損害及抗氧化酶如SOD、GSH-Px活性降低，是衰老發(fā)生的重要原因。因此，抗氧化與抗衰老是密切相關(guān)的，許多延緩衰老的保健方法或保健食品都具有不同程度的抗氧化作用。SOD、GSH-Px活性以及ROS、LF、MDA水平可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度及機(jī)體清除自由基的能力，是抗氧化和抗衰老研究中常用到的指標(biāo)。SOD和GSH-Px是機(jī)體的抗氧化酶，SOD能特異清除體內(nèi)氧自由基，把氧自由基歧化生成過(guò)氧化氫〔12〕，然后通過(guò)GSH-Px將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水發(fā)揮抗氧化作用，通過(guò)檢測(cè)SOD和GSH -Px活性可以推知機(jī)體抗氧化能力。

研究表明〔8，9〕，針刺和點(diǎn)灸環(huán)跳穴、足三里等能提高SOD含量、降低MDA水平，提示針刺和點(diǎn)灸環(huán)跳穴、足三里等穴位具有抗氧化損傷的作用。另外有研究顯示〔10，11〕，針刺陽(yáng)陵泉能提高SOD活性，減輕缺血再灌注和MPTP誘導(dǎo)帕金森大鼠模型新紋狀體的氧化損傷。因此，針刺和點(diǎn)灸環(huán)跳穴、足三里、陽(yáng)陵泉等具有潛在的抗氧化、抗衰老作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)也表明D-半乳糖注射造模已引起模型動(dòng)物體內(nèi)氧化損傷，這是衰老發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，采用壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸和針挑療法干預(yù)后，ROS、MDA和LF水平均有不同程度的下降，而SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，以聯(lián)合組的表現(xiàn)最明顯。提示壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸和針挑療法可從提高抗氧化能力、減少氧化產(chǎn)物生成以及增強(qiáng)抗氧化酶活性方面發(fā)揮抗衰老作用。

氧化損傷可引起機(jī)體細(xì)胞功能損害，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而表現(xiàn)出衰老的特征。近來(lái)研究〔13〕顯示端粒酶使細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，端粒酶活性表達(dá)高低能夠反映機(jī)體抗衰老能力的高低〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示藥線點(diǎn)灸和針挑聯(lián)用可以增強(qiáng)端粒酶活性而發(fā)揮抗衰老作用。

壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸療法是廣西壯族地區(qū)群眾常用的特色療法，壯醫(yī)藥理論和實(shí)踐已證明其具有溫經(jīng)通絡(luò)止痛的效果，通過(guò)疏通“龍路”、“火路”，通行血脈、祛邪外出，達(dá)到“天地人”三氣同步、氣血平衡的健康狀態(tài)，對(duì)慢性疼痛、風(fēng)濕痹痛等慢性病療效確切。針挑療法同作為壯醫(yī)特色療法，壯醫(yī)專家黃漢儒〔15〕認(rèn)為針挑療法的作用機(jī)制是挑刺可以激發(fā)人體正氣，將郁滯體內(nèi)的有形或無(wú)形之毒從體表針挑點(diǎn)驅(qū)出，體現(xiàn)壯醫(yī)理論“調(diào)氣、祛毒”的治療原則。本實(shí)驗(yàn)探討藥線點(diǎn)灸和針挑療法抗氧化、抗衰老的機(jī)制，觀察其作為養(yǎng)生保健方法的可能性，為將其作為新的療養(yǎng)手段提供依據(jù)。

4　參考文獻(xiàn)

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〔2014-09-17修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者:鄭建宇(1958-)，女，教授，主任醫(yī)師，主要從事針灸臨床與基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No．81360579)

〔中圖分類號(hào)〕R244.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4429-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.005