連曉陽(yáng)，陳少清，方憶生，王詩(shī)忠，林建平

電針三陰交、陰陵泉對(duì)腓腸肌損傷大鼠損傷后修復(fù)及生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

連曉陽(yáng)，陳少清，方憶生，王詩(shī)忠，林建平

[摘要]目的探討電針治療腓腸肌損傷的可能機(jī)制。方法30只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為空白組(n=10)、模型組(n=10)和電針組(n=10)。模型組和電針組采用腓腸肌鈍挫傷的方法制備模型，電針組電針三陰交、陰陵泉穴14 d。治療結(jié)束后取腓腸肌組織行HE染色，免疫組化法檢測(cè)大鼠腓腸肌組織、ELISA法檢測(cè)大鼠血清堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，電針組損傷程度較輕，腓腸肌組織bFGF、IGF-1表達(dá)明顯升高(P<0.01)，血清含量升高(P<0.05)。結(jié)論電針可以促進(jìn)腓腸肌損傷大鼠損傷后修復(fù)，其機(jī)制可能與上調(diào)修復(fù)因子bFGF和IGF-1的表達(dá)水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腓腸肌損傷；電針；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；大鼠

[本文著錄格式]連曉陽(yáng)，陳少清，方憶生，等.電針三陰交、陰陵泉對(duì)腓腸肌損傷大鼠損傷后修復(fù)及生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(11): 1273-1276.

CITED AS: Lian XY, Chen SQ, Fang YS, et al. Effects of electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan acupoints on muscle repair and expression of growth factors in gastrocnemius muscle damaged rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(11): 1273-1276.

肌肉骨骼系統(tǒng)損傷是意外傷害中發(fā)病率最高的一類(lèi)損傷[1]，腓腸肌損傷在劇烈活動(dòng)的運(yùn)動(dòng)員中尤為常見(jiàn)[2]。有研究表明，電針三陰交等穴可促進(jìn)腓腸肌損傷的修復(fù)[3-4]，但其機(jī)制尚未完全闡明。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族成員之一[5]，在FGF家族中，抗組織損傷和促進(jìn)修復(fù)方面作用最強(qiáng)[6]；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (insulin-likegrowth factor-1, IGF-1)是一類(lèi)廣譜性促生長(zhǎng)因子[7]，對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)、分化起重要作用[8]。b-FGF和IGF-1均是肌肉損傷修復(fù)過(guò)程中的重要因子。本研究觀察電針三陰交、陰陵泉穴對(duì)腓腸肌損傷后組織和血清中bFGF及IGF-1表達(dá)的變化，探討電針三陰交、陰陵泉穴治療腓腸肌損傷的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)8周齡健康Sprague-Dawley雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCK(滬)2012-0002。

1.1.2儀器

DM IL LED倒置顯微鏡：LEICA儀器有限公司。Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Heraeus PICO 17低溫高速離心機(jī)：美國(guó)THERMO公司。G-6805華佗牌電針儀：上海華誼儀器廠。

1.1.3試劑

兔抗bFGF、IGF-1抗體：博奧森公司。DAB顯色劑：邁新生物技術(shù)公司。bFGF、IGF-1酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒：上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組

大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將大鼠編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(n=10)、模型組(n=10)和電針組(n=10)。

1.2.2造模

采用鈍挫腓腸肌建立大鼠腓腸肌損傷模型[9]。模型組和電針組大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剪除大鼠右下肢腓腸肌處皮毛。大鼠俯臥位，保持踝關(guān)節(jié)跖屈90°，使腓腸肌位于脛腓骨內(nèi)側(cè)。標(biāo)記腓腸肌肌腹中點(diǎn)。打擊器質(zhì)量500 g，由48 cm處自由落下，垂直打擊標(biāo)記部位，打擊器與腓腸肌接觸面積約1×1 cm，動(dòng)能為2.352 J。連續(xù)打擊3次。

1.2.3干預(yù)

電針組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》等[10-11]取大鼠三陰交和陰陵泉穴，應(yīng)用華佗牌G-6805電針儀，予疏密波，頻率2/10 Hz，電流強(qiáng)度2 mA，以右后肢出現(xiàn)輕微顫抖為準(zhǔn)。每次30 min，每天1次，連續(xù)14 d，從造模后第1天開(kāi)始治療。

空白組、模型組置于普通籠中飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.2.4 HE染色

治療14 d后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，銳性切取右后肢腓腸肌肌腹中段的病灶組織約1×1 cm。生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液漂洗，4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，石蠟包埋，切片厚5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木素和伊紅染色，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5免疫組化染色

將固定滿(mǎn)意的腓腸肌標(biāo)本制成石蠟切片(方法同上)。60°烤片1 h，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗、熱修復(fù)抗原，PBS沖洗封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，加二抗、三抗、DAB顯色，大量自來(lái)水沖洗。蘇木素復(fù)染、鹽酸分色，PBS返藍(lán)，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察、采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。高倍鏡下(200倍)取5個(gè)視野，測(cè)量其平均光密度值(MD)。

1.2.6 ELISA

10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰臥固定在解剖臺(tái)上，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 ml。4℃4000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中，-20℃保存?zhèn)錅y(cè)。

從酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒取出包被有抗bFGF或IGF-1特異抗體的酶標(biāo)板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)大鼠血清100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，加入生物素化抗大鼠bFGF或IGF-1抗體100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素100 μl，37℃溫育30 min。洗滌液洗板5次，吸水紙拍干，每孔加入TMP顯色液100 μl，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μl。15 min內(nèi)在450 nm測(cè)定OD值；據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示。符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；不符合正態(tài)分布，采用多組樣本秩和(Kruskal-Wallis)檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1HE染色

模型組肌纖維排列紊亂，可見(jiàn)大量破裂肌纖維，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肌纖維腫脹伴有透明樣變性，肌纖維明顯壞死。電針組肌組織內(nèi)瘀血、水腫、出血灶大部分消失，血管增生，膠原纖維增生，與正常軟組織相比較已基本恢復(fù)正常；新生肌纖維排列整齊，炎癥基本吸收?？瞻捉M未見(jiàn)病理改變(圖1)。

2.2免疫組化染色

與空白組相比，模型組腓腸肌組織中bFGF和IGF-1表達(dá)水平上升(P<0.05)。與模型組相比，電針組腓腸肌組織中bFGF和IGF-1表達(dá)水平明顯上升(P< 0.01)。見(jiàn)圖2、圖3、表1。

圖1　各組大鼠腓腸肌病理改變(HE染色，200×)

圖2　各組大鼠腓腸肌bFGF表達(dá)(免疫組化染色，200×)

圖3　各組大鼠腓腸肌IGF-1表達(dá)(免疫組化染色，200×)

2.3ELISA

與空白組相比，模型組血清中bFGF和IGF-1含量明顯上升(P<0.01)。與模型組相比，電針組血清中bFGF和IGF-1含量上升(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組血清bFGF、IGF-1水平(ng/ml)

3　討論

肌肉損傷在所有運(yùn)動(dòng)損傷中約占10%～55%[12]，鈍挫傷是常見(jiàn)的損傷類(lèi)型之一[1]。損傷的肌肉通常可以通過(guò)肌肉再生進(jìn)行修復(fù)，但不能完全恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能[13]。

現(xiàn)代研究已證實(shí)，電針能促進(jìn)骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化，進(jìn)而促進(jìn)腓腸肌損傷的修復(fù)[14-15]。中醫(yī)認(rèn)為，脾主肌肉，肌肉疾病皆可從脾入手。三陰交、陰陵泉均為脾經(jīng)要穴。本研究顯示，電針三陰交、陰陵泉可以促進(jìn)腓腸肌損傷大鼠損傷后修復(fù)。與其他研究結(jié)果一致[3,16]。

FGF是目前已知最大的生長(zhǎng)因子家族之一[17]。bFGF是重要的有絲分裂促進(jìn)因子，也是形態(tài)發(fā)生和分化的誘導(dǎo)因子，在正常生理及病理過(guò)程中參與生長(zhǎng)發(fā)育和組織損傷的修復(fù)過(guò)程[18]。Xu等研究表明，bFGF能促進(jìn)失神經(jīng)腓腸肌的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，延緩肌纖維萎縮和抑制肌纖維結(jié)締組織增生[19]。張朝研究發(fā)現(xiàn)，bFGF在損傷后7 d內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在7～14d達(dá)到峰值[20]。馮鑫等研究發(fā)現(xiàn)，外源性bFGF可以降低損傷肌肉組織中波形蛋白的特異性表達(dá)及肌肉組織纖維化程度，促進(jìn)肌肉損傷后結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)[21]。同時(shí)，bFGF可以促進(jìn)肌肉拉傷后結(jié)蛋白表達(dá)，提高肌肉再生能力[22]。

IGF-1是一類(lèi)廣譜的促生長(zhǎng)因子，化學(xué)結(jié)構(gòu)與胰島素原類(lèi)似[23]。在骨骼肌的增殖階段，IGF-1可以增加衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。

IGF-1對(duì)肌肉再生的調(diào)節(jié)由多信號(hào)通路介導(dǎo)。IGF-1與其受體的α亞基結(jié)合后，可使β亞基自身磷酸化，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。MAPK通路可將信號(hào)傳至核內(nèi)，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的效應(yīng)[24]。

IGF-1可通過(guò)IGF-1受體發(fā)揮生長(zhǎng)激素的局部效應(yīng)。IGF-1受體位于細(xì)胞漿內(nèi)，部分具有酪氨酸激酶活性功能，可刺激肌纖維對(duì)氨基酸的利用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成；還可抑制蛋白質(zhì)的降解，從而提高蛋白質(zhì)的凈增率[25]。

因此，IGF-1可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖，增加蛋白質(zhì)合成，減少蛋白質(zhì)降解等途徑促進(jìn)骨骼肌損傷后的修復(fù)與再生。

本研究表明，電針在一定程度上可以上調(diào)腓腸肌組織和血清中bFGF和IGF-1的表達(dá)，這可能是電針促進(jìn)腓腸肌損傷后修復(fù)的機(jī)制之一。

綜上所述，電針三陰交、陰陵泉可促進(jìn)腓腸肌損傷后修復(fù)，其作用機(jī)制可能與上調(diào)bFGF和IGF-1在腓腸肌組織和血清中表達(dá)水平有關(guān)。

由于腓腸肌損傷的機(jī)制復(fù)雜，以及電針多靶點(diǎn)的綜合作用，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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·綜述·

Effects of Electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan Acupoints on Muscle Repair and Expression of Growth Factorsin GastrocnemiusMuscleDamaged Rats

LIANXiao-yang, CHENShao-qing, FANGYi-sheng, WANGShi-zhong, LINJian-ping
Fujian University of Traditional ChineseMedicine, Fuzhou, Fujian350122, China

Abstract:ObjectiveTo investigatetheeffectsof electroacupunctureat Sanyinjiao (SP6) and Yinlingquan (SP9) on musclerepair in the gastrocnemiusmuscledamaged ratsand itspossiblemechanism. Methods30 male Sprague-Dawley ratswererandomly divided into blank group (n=10), model group (n=10) and electroacupuncture group (n=10). The latter 2 groups were modeled with gastrocnemius muscle crush injury. Theelectroacupuncturegroup received electroacupunctureat Sanyinjiao and Yinlingquan for 14 days. Their gastrocnemiuswas observed with HE staining, and theexpressionsof basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-likegrowth factor-1 (IGF-1) in gastrocnemius tissues and the serum were determined with immunochemical assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the model group, there was less damage in the electroacupuncture group, with more expression of bFGF and IGF-1 in tissues (P<0.01) and serum (P<0.05). Conclusion Electroacupuncture can promote muscle repair after gastrocnemius muscle damage in rats, whichmay berelatedtotheincreaseof thebFGFand IGF-1expressioningastrocnemiustissueandserum.

Keywords:gastrocnemiusmuscledamage; electroacupuncture; basicfibroblast growthfactor; insulin-likegrowthfactor-1; rats

(收稿日期：2015-08-02修回日期：2015-08-31)

作者簡(jiǎn)介：作者單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州市350122。連曉陽(yáng)(1990-)，男，漢族，福建三明市人，碩士研究生，主要研究方向：脊柱疾病康復(fù)的基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者：林建平(1985-)，女，漢族，福建福州市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：脊柱疾病康復(fù)的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: 283959283@qq.com。

基金項(xiàng)目：1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81303017)；2.校管課題重點(diǎn)學(xué)科專(zhuān)項(xiàng)(No.X2014081-學(xué)科)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.008

[中圖分類(lèi)號(hào)]R685

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2015)11-1273-04