王鮮，黃佳，柳維林，上官豪，鄭薏，王露露，林云嬌，陶靜,3，陳立典

電針對缺血再灌注損傷大鼠缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞活化的影響

王鮮1，黃佳1，柳維林1，上官豪1，鄭薏1，王露露1，林云嬌1，陶靜1,3，陳立典2

[摘要]目的探討電針對缺血再灌注損傷大鼠缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞活化的影響。方法36只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=12)、模型組(n=12)和電針組(n=12)。模型組與電針組均采用改良Longa法制備左側大腦中動脈閉塞模型，缺血2 h后恢復血供。電針組電針曲池、足三里穴治療3 d。HE染色觀察缺血周圍區(qū)皮質神經細胞損傷情況；免疫組織化學法觀察缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞活化標記物ED1的表達；Westernblotting檢測缺血周圍區(qū)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β 和IL-6的表達。結果與模型組相比，電針組大鼠神經功能缺損癥狀改善(P<0.05)，缺血周圍區(qū)皮質神經細胞損傷減輕，ED1陽性細胞數減少(P<0.05)，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達降低(P<0.05)。結論電針對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可能與抑制缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞的活化及促炎因子的釋放相關。

[關鍵詞]腦缺血再灌注損傷；電針；小膠質細胞；炎癥；大鼠

[本文著錄格式]王鮮，黃佳，柳維林，等.電針對缺血再灌注損傷大鼠缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞活化的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(11): 1251-1255.

CITED AS: Wang X, Huang J, Liu WL, et al. Effectsof electroacupunctureon activation of microgliain peri-infarct cortex of cerebral ischemia-reperfusioninjury rats[J]. Zhongguo Kangfu LilunYu Shijian, 2015, 21(11): 1251-1255.

腦卒中是導致死亡的第二大原因，占死亡人數的11%，我國每年新發(fā)腦卒中病例200萬人次[1-2]，而存活者中，約55%～75%留有肢體功能障礙[3]。大量臨床及基礎研究證明，電針療法是治療腦卒中行之有效的方法之一，但其具體作用機制尚未完全清楚。

炎癥反應在缺血性腦損傷中起關鍵作用，而小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)的免疫細胞，具有吞噬、抗原提呈、表達免疫相關因子及遷移的功能，在神經生理和病理進程中起關鍵作用[4]。當中樞神經系統(tǒng)發(fā)生損傷、卒中、變性以及腫瘤入侵等病變時，大量活化的小膠質細胞遷移到受損區(qū)域發(fā)揮免疫調節(jié)作用。缺血周圍區(qū)一直是神經科學研究的熱點[5]。研究表明，腦損傷誘導小膠質細胞活化并釋放促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α, TNF-α)、白細胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-6。促炎細胞因子有細胞毒性作用，并與炎癥反應、壞死和凋亡相關，加重腦損傷[6-8]。

我們前期研究發(fā)現，電針曲池、足三里穴可抑制缺血再灌注損傷大鼠腦組織及血液中促炎因子的釋放，從而減少腦梗死體積，發(fā)揮腦保護作用[9]。還有研究表明，針刺或電針預處理可以抑制腦缺血損傷大鼠海馬區(qū)小膠質細胞的活化，抑制氧化應激[10-12]。本研究觀察腦缺血再灌注損傷后缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞的活化，探討電針曲池、足三里穴治療缺血性腦卒中的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

成年健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠36只，體質量(250±30) g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，生產許可證號：SCXK(滬)2014-0002。采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、電針組，每組12只。實驗過程嚴格遵照國際動物保護和指南的規(guī)定。

1.2主要試劑和儀器

ED1一抗：AbD SEROTEC公司。TNF-α、IL-1β、IL-6、β-actin一抗，辣根過氧化物酶二抗：CELL SIGNALINGTECHNOLOGY公司。G6805型電針儀：上海華誼公司。Leiss LSM710光學顯微鏡：CARL ZEISS公司。Image-lab圖像分析系統(tǒng)：BIORAD HERCULES公司。

1.3模型制備

動物術前禁食12 h。參考Longa方法[13]，行左側大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)術。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，無菌操作。頸正中切口，暴露并鈍性分離左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，尼龍線依次結扎頸總動脈、頸外動脈，微動脈夾夾閉遠端頸內動脈。頸總動脈上近分叉處約5mm處剪一“V”型小口，線栓經頸總動脈插入頸內動脈，當進入大腦中動脈稍遇阻力時，即可停止，進線長度約18～22 mm。結扎頸內動脈，傷口常規(guī)縫合。2h后拔出線栓實現再灌注。

假手術組只分離動脈，不結扎和插線。

術后，動物白熾燈照射取暖。手術過程維持肛溫37℃左右。動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，判斷模型是否成功。

1.4干預方法

術后第2天，電針組大鼠參考《實驗針灸學》[14]的定位方法，取曲池、足三里穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，斜刺右側患肢穴位0.2～0.3 cm，接G6805電針儀，疏密波，頻率1～20 Hz，以肢體輕度抖動為度。每次30min，每天1次，共3d。

假手術組及模型組以同樣方法抓取固定，不進行電針刺激。

1.5神經行為學評分

各組大鼠在缺血再灌注后2 h及電針治療3 d，由1名對研究不知情的觀察者按Longa評分[13]，對大鼠的神經功能缺損程度進行評估。0分，無神經功能缺損體征；1分，不能伸展對側前爪；2分，向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.6檢測方法

1.6.1 HE染色

干預結束后，大鼠10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水200 ml經左心室快速沖洗，4%多聚甲醛(pH=7.4) 250 ml灌流固定。取腦置4%多聚甲醛內，4℃固定24～48 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm。常規(guī)梯度脫蠟入水，HE染色，于顯微鏡下觀察大鼠腦左側缺血周圍區(qū)皮質組織形態(tài)。

1.6.2免疫組織化學染色

腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，置檸檬酸緩沖液中(pH=6.0)，微波修復10 min，3% H2O2室溫孵育5 min；PBS漂洗3次；10%正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min；加入ED1一抗(1∶150)，濕盒4℃過夜；加生物素標記二抗，室溫10min；加鏈霉卵白素-過氧化物酶，室溫10 min；PBS漂洗3次；DAB顯色1 min；自來水沖洗，蘇木素復染細胞核10 min，自來水洗10 min以上。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。400倍鏡下觀察。陽性細胞細胞核呈紫藍色，胞漿呈棕黃色。左側缺血周圍區(qū)皮質隨機取4個視野，計算每個視野免疫組織化學染色反應陽性細胞數，取平均值。

1.6.3 Westernblotting

大鼠左側缺血周圍區(qū)皮質液氮速凍，-80℃冰箱保存。檢測時每100 mg腦組織加入1 ml細胞裂解液和10μl苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)儲存液提取蛋白質?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度。腦組織加熱變性后，取50μg，12% SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加TNF-α、IL-1β、IL-6一抗(1∶1000)，β-actin，4℃孵育過夜。加人辣根過氧化物標記的二抗，室溫孵育1 h。避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，反應1 min。采用Image-lab軟件對目的條帶行灰度分析，計算其與β-actin比值。

1.7統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數據采用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1神經功能缺損評分

干預前，與假手術組相比，模型組及電針組大鼠神經行為學評分均明顯升高(P<0.01)，模型組和電針組間無顯著性差異(P>0.05)。干預后，電針組神經缺損評分較模型組降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組干預前后神經功能缺損評分比較

2.2HE染色

假手術組神經細胞胞體呈多形性，胞質豐富，核圓形，核仁清晰可見。模型組神經細胞排列不規(guī)則，胞體明顯縮小，胞質濃染或嗜伊紅，核固縮，被深染的細胞包圍，可能是炎性細胞。與模型組相比，電針組核皺縮或碎裂、溶解的神經細胞減少，細胞浸潤減少。見圖1。

2.3ED1免疫組織化學染色

ED1為活化的小膠質細胞標記物。假手術組偶見ED1陽性細胞。模型組可見大量小膠質細胞胞體增大，形態(tài)變?yōu)閳A狀、阿米巴狀。與假手術組比較，模型組陽性細胞數明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針組陽性細胞數減少(P<0.05)。見圖2、表2。

表2　各組ED1陽性細胞計數

2.4Westernblotting

模型組TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達較假手術組增加(P<0.05)，電針組較模型組降低(P<0.05)。見表3。

表3　各組促炎因子蛋白表達比較(/β-actin)

圖1　各組缺血周圍區(qū)皮質神經細胞形態(tài)(HE染色，200×)

圖2　各組缺血周圍區(qū)皮質ED1的表達(免疫組織化學染色，400×)

3　討論

祖國醫(yī)學認為，中風(腦卒中)的基本病機總屬陰陽失調，氣血逆亂。根據中醫(yī)理論“治痿獨取陽明”原則，曲池穴是陽明經合穴，足三里穴是足陽明經合穴，對缺血性中風療效確切，臨床應用廣泛。本研究顯示，電針曲池、足三里能促進缺血再灌注損傷大鼠神經功能恢復。

近年研究發(fā)現，腦缺血過程中存在炎性反應，包括炎性因子和趨化因子產生，小膠質細胞和星形膠質細胞活化[15-17]。腦缺血時，局部腦組織細胞氧糖剝奪，神經元死亡或內源性信號改變，小膠質細胞激活；活化的小膠質細胞進一步釋放具有細胞毒性的炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，加重神經元損害[18-21]。

TNF-α是很強的免疫介質和促炎細胞因子，腦缺血后的快速上調與神經炎癥密切相關[22]?；罨男∧z質細胞釋放過量IL-1β、TNF-α，導致神經元損傷[23]；注入小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素或吡格列酮，可以減少促炎因子的表達[24-25]。近年有學者發(fā)現，P2Y12受體及其p38MAPK/PKC信號通路介導小膠質細胞的活化及促炎因子的釋放[26-27]。姜酮酚在缺血性腦損傷后具有神經保護作用，與抑制缺血周圍區(qū)小膠質細胞活化引起的神經炎性反應，減少促炎因子TNF-α、IL-6的釋放有關[8]。肢體缺血再灌注模型中發(fā)現，電針預處理可以抑制大鼠海馬小膠質細胞的活化，減輕氧化應激[12]。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注后，缺血周圍區(qū)皮質活化的小膠質細胞數量顯著增加，促炎因子表達增加；電針后，缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞活化被抑制，該區(qū)域促炎因子表達下降。

綜上所述，電針曲池、足三里穴可能通過抑制缺血周圍區(qū)皮質小膠質細胞的活化及促炎因子的釋放，起到神經保護作用。電針調控小膠質細胞活化的信號途徑，有待進一步研究。

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·專題·

作者單位：1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建福州市350122；2.福建中醫(yī)藥大學，福建福州市350122；3.福建省康復技術重點實驗室，福建福州市350122。作者簡介：王鮮(1987-)，女，河南三門峽市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復及認知科學。通訊作者：陳立典(1963-)，男，福建政和市人，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：神經康復及認知科學。E-mail: fjtcm1958@sina.com。

Effectsof Electroacupunctureon Activation of Microglia in Peri-infarct Cortex of Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rats

WANG Xian1, HUANG Jia1, LIU Wei-lin1, SHANGGUAN Hao1, ZHENG Yi1, WANG Lu-lu1, LIN Yun-jiao1, TAO Jing1,3, CHENLi-dian2
1. Collegeof Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 3. Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology, Fuzhou, Fujian350122, China

Abstract:Objective To explore the effect of electroacupuncture on activation of microglia in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods36 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=12), model group (n=12) and electroacupuncturegroup (n=12). Thelatter two groupswereoccluded theleft middlecerebral arterieswith modified Longa'smethod for 2 hours and reperfused. The electroacupuncture group received electroacupuncture at Quchi (LI11) and Zusanli (ST36) acupoints for 3 days. Thenervecell damageinperi-infarct cortex wasobservedwith HEstaining, whiletheexpressionof ED1wasdeterminedwithimmunohistochemical staining, and the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) and IL-6 were determined with Western blotting. ResultsTheneurological deficitsscoreimproved significantly in theelectroacupuncturegroup (P<0.05), with lessnervecell damage, lessnumber of ED1 positivemicroglia(P<0.05) and lesslevelsof TNF-α, IL-1β and IL-6 (P<0.05), compared with themodel group. Conclusion Theelectroacupunctureat Quchi (LI11) and Zusanli (ST36) acupointscan protect brain from ischemia-reperfusion injury, which might beassociatedwithinhibitingthemicroglial activationandproinflammatory responseinperi-infarct cortex.

Keywords:cerebral ischemia-reperfusioninjury; electroacupuncture; microglia; inflammation; rats

(收稿日期：2015-09-01修回日期：2015-10-15)

基金項目：1.國家自然科學基金項目(No.81273835; No.81403462)；2.福建中醫(yī)藥大學重點學科專項基金項目(No.X2014069-學科)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.003

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)11-1251-05