傘云琨，張晉霞，劉斌，劉穎，李世英

養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)超微結構及p38絲裂原活化蛋白激酶蛋白表達的影響

傘云琨，張晉霞，劉斌，劉穎，李世英

[摘要]目的觀察養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)超微結構及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表達的影響。方法180只Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組、血管性癡呆模型組(模型組)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組)，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制作血管性癡呆模型，分別在術后1、2、4、8周采用透射電鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)超微結構變化，免疫組化法和Western blotting法檢測海馬CA1區(qū)p38MAPK水平。結果模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元大量固縮，細胞核溶解，異染色質邊集，線粒體腫脹。治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元核膜較完整，核染色質分布較均勻，胞質內(nèi)線粒體及其他細胞器基本正常。與假手術組相比，模型組各時間點p38MAPK蛋白表達明顯增多(P<0.01)，4周時達高峰；與模型組比較，治療組各時間點p38MAPK蛋白表達明顯減少(P<0.01)。結論養(yǎng)血清腦顆?？筛纳蒲苄园V呆模型大鼠海馬CA1區(qū)損傷的神經(jīng)元超微結構，可能與抑制p38MAPK蛋白的表達有關。

[關鍵詞]血管性癡呆；養(yǎng)血清腦顆粒；p38絲裂原活化蛋白激酶；超微結構；大鼠

[本文著錄格式]傘云琨，張晉霞，劉斌，等.養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)超微結構及p38絲裂原活化蛋白激酶蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(11): 1245-1250.

CITED AS: San YK, Zhang JX, Liu B, et al. Effect of YangxueQingnao Granuleon ultrastructuresand expression of p38 mitogen activated protein kinases in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(11): 1245-1250.

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是發(fā)生在腦血管疾病基礎上的以記憶、認知功能缺損為主，或伴有語言、視覺空間技能及情感或人格障礙的獲得性智力的持續(xù)性損害[1-2]。我們在前期血管性癡呆相關研究的基礎上[3-8]，進一步探討血管性癡呆的治療機制。

海馬結構是與學習、記憶等高級神經(jīng)活動有關的重要部位，是對腦缺血最敏感的部位之一。血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)細胞超微結構發(fā)生破壞[9]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的信號轉導通路。p38MAPK是MAPK信號通路的重要成員，與血管性癡呆的發(fā)生和發(fā)展密切相關[10-11]。

中藥養(yǎng)血清腦顆粒具有滋陰養(yǎng)血、平肝潛陽、活血通絡的功效[12]。臨床應用養(yǎng)血清腦顆粒能明顯改善血管性癡呆患者認知功能和日常生活能力[13]。但其具體作用機制尚不明確。

本研究觀察養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)超微結構及p38MAPK蛋白表達的影響，探討?zhàn)B血清腦顆粒治療血管性癡呆疾病的可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔健康雄性Sprague-Dawley大鼠180只，月齡2～3個月，體質量250～300 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號SCXK(京)2013-0013。在華北理工大學屏障環(huán)境動物實驗室自由進食喂養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自然光照。實驗前適應喂養(yǎng)2周。

1.2主要試劑與儀器

養(yǎng)血清腦顆粒，國藥準字Z10960082，批號130366：天津天士力制藥股份有限公司。兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體：北京博奧森生物公司。DAB顯色液：北京中杉生物有限公司。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質量標準蛋白。

低溫離心機：SIGMA公司。電凝儀：張家港市航天醫(yī)療電器有限公司。切片機：上海億欣生物科技有限公司。日立H-7650電子顯微鏡。

1.3動物分組

大鼠編號，用隨機數(shù)生成器抽取不同數(shù)字，將大鼠分為假手術組、血管性癡呆模型組(模型組)和養(yǎng)血清腦顆粒治療組(治療組)，在模型制備成功后再隨機分為造模術后1周、2周、4周和8周4個亞組，每個亞組15只大鼠，其中3只用于電鏡檢測，6只用于免疫組織化學檢測，6只用于Westernblotting檢測。

1.4模型制備

采用改良Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)制備大鼠癡呆模型。大鼠術前8～12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定，常規(guī)消毒，沿背側頸正中切開，逐層鈍性分離，暴露雙側第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針灼燒翼小孔中的椎動脈，造成永久性閉塞。大鼠仰臥位固定，腹側頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，以細線穿線備用。24 h后，大鼠仰臥位固定，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，每次5 min，間隔10 min，共夾閉3次。局部傷口縫合前，滴慶大霉素預防感染。術后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)觀察。

假手術組僅分離雙側頸總動脈，不做其他處理。

1.5給藥方法

各組均灌胃給藥，每天1次。假手術組、模型組予生理鹽水10 ml/kg，治療組將養(yǎng)血清腦顆粒用蒸餾水配置成混懸液(濃度0.32 g/ml)，每天10 ml/kg灌胃[14]。

1.6電鏡觀察

大鼠喂養(yǎng)至相應時點，脊髓脫臼法處死大鼠后立即斷頭，按《大鼠腦立體定位圖譜》在冰盤上分離出大鼠海馬CA1區(qū)。冠狀切厚1 mm薄片，4℃下2.5%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定1 d。1%鋨酸固定，脫水，包埋，切超薄切片。透射電鏡下觀察神經(jīng)元超微結構，攝相。

1.7免疫組織化學檢測

大鼠喂養(yǎng)至相應時點，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，心腔灌注固定后斷頭取腦，取視交叉至乳頭體組織，切片，包埋。在切片機上連續(xù)切片，厚5 μm，置60℃烤箱烘烤備用。60℃烤片30 min，取出后脫蠟水化；3%過氧化氫室溫25 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。枸櫞酸高壓熱修復，冷卻。血清封閉10 min后滴加稀釋p38MAPK抗體一抗(1∶200)，放入濕盒，4℃冰箱過夜；滴加生物素化二抗37℃孵育1 h后DAB顯色。蘇木素復染，鹽酸酒精分化后，封片。光鏡下觀察，p38MAPK蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)。高倍鏡下選取6個不重疊的視野，行p38MAPK蛋白陽性細胞計數(shù)，取平均數(shù)。

1.8Westernblotting

大鼠喂養(yǎng)至相應時點，脊髓脫臼法處死后立即斷頭于冰上取腦，將取出的組織置于15 ml離心管中，加入組織裂解液，30 min后用組織勻漿機12000 r/min勻漿，細胞懸液4℃12000r/min離心10min，取上清液-80℃保存。蛋白定量后分裝，PBS調(diào)蛋白濃度至800 μg/ml，加入等體積上樣緩沖液，沸水煮至少5 min。冷卻至室溫，放入4℃冰箱備用。取蛋白樣品60 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，以半干轉轉膜至NC膜，室溫封閉至少1 h。加抗p38MAPK抗體(1∶500)，4℃冰箱孵育過夜。加稀釋羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃反應2 h，ECL顯色，暗室膠片曝光顯影，ImageJ分析。

1.9統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，用SPSS17.0軟件處理。兩組間比較采用t檢驗；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α= 0.05。

2　結果

5只由于病情過重淘汰，另有3只死亡。均予補充。

2.1電鏡觀察

假手術組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結構完整，核形態(tài)規(guī)則，核膜完整，核內(nèi)染色質分布均勻，核仁清晰，胞質內(nèi)細胞器豐富，線粒體無腫脹，嵴清晰可見，可見溶酶體、粗面內(nèi)質網(wǎng)(圖1)；模型組神經(jīng)元大量固縮，細胞核溶解，異染色質邊集，胞質內(nèi)線粒體等細胞器腫脹明顯，內(nèi)質網(wǎng)擴張、空泡化，1～8周逐漸加重(圖1)。治療組神經(jīng)元核膜較完整，核內(nèi)染色質分布較均勻，胞質內(nèi)線粒體及其他細胞器結構基本正常，偶見少量染色質凝集，線粒體輕度腫脹(圖1)。

2.2免疫組化染色

假手術組海馬CA1區(qū)可見少量p38MAPK蛋白表達。模型組各時間點與假手術組相比，p38MAPK蛋白表達明顯增多(P<0.01)，4周時達高峰。治療組各時間點與模型組比較，p38MAPK蛋白表達明顯減少(P< 0.01)。見表1、圖2。

表1　各組海馬CA1區(qū)p38MAPK蛋白陽性細胞數(shù)

2.3Westernblotting

假手術組可見少量p38MAPK蛋白表達。與假手術組相比，模型組各時間點p38MAPK蛋白表達明顯增多(P<0.01)。與模型組比較，治療組各時間點p38MAPK蛋白表達明顯減少(P<0.01)。見表2。

表2　各組海馬CA1區(qū)p38MAPK蛋白表達

圖1　各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結構(8000×)

圖2　各組大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK表達(免疫組化染色，400×)

3　討論

慢性腦缺血是血管性癡呆發(fā)生的主要病因之一[15]。本研究采用4-VO法制作血管性癡呆大鼠模型，24 h后反復用動脈夾夾閉造成腦缺血，是目前國內(nèi)外公認的理想的血管性癡呆動物模型，已被廣泛用于血管性癡呆治療的研究。血管性癡呆模型制作成功的標準已在我們先前的研究中報道[15]。

海馬是與學習記憶等高級神經(jīng)活動有關的重要核團，參與腦內(nèi)信息存儲及記憶功能；CA1區(qū)與空間辨別及學習記憶關系最為密切[16]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)缺血性病變是血管性癡呆的重要病理基礎[9,17]。本研究顯示，血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生明顯結構異常，而養(yǎng)血清腦顆?？筛纳坪ｑRCA1區(qū)損傷，起到對神經(jīng)元的保護作用，從而改善血管性癡呆大鼠的認知功能。

MAPK為一組以級聯(lián)方式依次活化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)信號傳遞的交匯點，可將細胞外信息傳遞至細胞核，直接調(diào)節(jié)轉錄因子活性，調(diào)控基因表達，廣泛存在于各種動物細胞內(nèi)，對于細胞周期和基因表達具有重要調(diào)控作用[18-19]。p38MAPK是MAPK家族的主要成員之一，位于胞質內(nèi)。p38 MAPK磷酸化后形成P-p38MAPK，產(chǎn)生一系列生物學效能，參與細胞增殖、分化，在炎性反應、休克、細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用[20-22]，與腦缺血損傷及血管性癡呆的發(fā)生和發(fā)展有密切關系[10-11,23]。

本研究顯示，血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK蛋白表達增多，4周時達高峰。與文獻報道結果一致[11,18]，說明p38MAPK信號通路在血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。

養(yǎng)血清腦顆粒主要由川芎、當歸、白芍、鉤藤、熟地黃、雞血藤、決明子、夏枯草、細辛、延胡索、珍珠母組成，在改善軟腦膜微循環(huán)、增加腦血管量、減輕腦損傷等方面具有顯著效果[24]。養(yǎng)血清腦顆粒具有養(yǎng)血活血、平肝潛陽的作用，標本兼治，符合中醫(yī)治療血管性癡呆的要求。作為現(xiàn)代中藥復方制劑，養(yǎng)血清腦顆粒具有多靶點、多環(huán)節(jié)、整體性調(diào)節(jié)機體的特點。文獻報道，養(yǎng)血清腦顆粒能抑制神經(jīng)細胞凋亡，保護神經(jīng)元缺血性損害[25-26]。本研究顯示，養(yǎng)血清腦顆?？梢种苝38MAPK的表達。

綜上所述，養(yǎng)血清腦顆?？杀Ｗo血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，可能與抑制p38MAPK蛋白的表達有關，進而改善血管性癡呆大鼠的認知功能。

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·專題·

Effect of Yangxue Qingnao Granuleon Ultrastructuresand Expression of p38 Mitogen Activated Protein Kinases in CA1Areaof Hippocampusof Vascular Dementia Rats

SANYun-kun, ZHANGJin-xia, LIU Bin, LIU Ying, LI Shi-ying
First Department of Neurology, theAffiliated Hospital of North ChinaUniversity of Scienceand Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Abstract:ObjectiveTo observetheeffect of Yangxue Qingnao Granuleon theultrastructuresand expression of p38 mitogen activated protein kinases(p38MAPK) in CA1 areaof hippocampusin vascular dementiarats. Methods180 Sprague-Dawley ratswererandomly divided into sham group, vascular dementia model group (model group) and Yangxue Qingnao Granule treatment group (treatment group). Thevascular dementiawasmodeled with modified Pulsineli'sfour-vessel occlusion. Theultrastructureof CA1 areawasobserved with transmission electron microscope, whiletheexpression of p38MAPK in CA1 areawasdetected with immunohistochemstry and Western blotting 1, 2, 4 and 8 weeksafter modeling. ResultsIn themodel group, pyknosis, nuclear dissolution, heterochromatin margination and mitochondriaswellingwerefoundinmost of theneuronsin CA1. Inthetreatment group, thedistributionof chromatinwaswell-proportioned, andmitochondrion and other organellewerenormal. In themodel group, theexpression of p38MAPK increased at each timepoint compared with the sham group (P<0.01), and peaked 4 weeks after modeling, and decreased in the treatment group compared with the model group (P< 0.01). Conclusion Yangxue Qingnao Granulecan improvetheultrastructureof neuronal in CA1 areaof hippocampusof vascular dementia rats, whichmay relatewiththeinhibitionof theexpressionof p38MAPK.

Keywords:vascular dementia; YangxueQingnao Granules; p38mitogenactivatedproteinkinases; ultrastructure; rats

(收稿日期：2015-07-26修回日期：2015-09-11)

作者簡介：作者單位：華北理工大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北唐山市063000。傘云琨(1989-)，女，漢族，河北唐山市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病及認知障礙。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究生導師。E-mail: liubintsh@126.com。

基金項目：1.河北省高等學校科學技術研究重點項目(No.ZH2012046)；2.河北省省級重大醫(yī)學科研課題(No.zd2013087)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.002

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)11-1245-06