郭德玉，孫芳玲，魏仁平，劉婷婷，程華，艾厚喜，田欣，祝自新，鄭文榮，王宇峰，王文,3

莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和成纖維生長(zhǎng)因子-2表達(dá)的影響

郭德玉1，孫芳玲1，魏仁平2，劉婷婷1，程華1，艾厚喜1，田欣1，祝自新1，鄭文榮1，王宇峰1，王文1,3

[摘要]目的觀察莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維生長(zhǎng)因子-2 (FGF-2)表達(dá)的影響。方法25只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、莫諾苷小劑量組(30 mg/kg)、莫諾苷中劑量組(90 mg/ kg)和莫諾苷大劑量組(270mg/kg)。采用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO) 30min再灌注模型。再灌注7d后利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)梗死側(cè)皮層VEGF和FGF-2蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血再灌注7 d后，各組梗死側(cè)大腦皮層VEGF、FGF-2的表達(dá)均有增加(P<0.05)；莫諾苷小、中、大劑量組VEGF表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05)；莫諾苷大劑量組FGF-2的表達(dá)進(jìn)一步顯著增加(P<0.001)。結(jié)論莫諾苷可以促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注后VEGF和FGF-2的表達(dá)，可能有助于促進(jìn)缺血性腦損傷后的血管新生。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注；莫諾苷；血管新生；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；成纖維生長(zhǎng)因子-2；大鼠

[本文著錄格式]郭德玉，孫芳玲，魏仁平，等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和成纖維生長(zhǎng)因子-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(11): 1241-1244.

CITED AS: Guo DY, Sun FL, Wei RP, et al. Effectsof morronisideon expression of vascular endothelial growth factor and fibroblast growthfactor-2inratsafter focal cerebral ischemia-reperfusion[J]. Zhongguo Kangfu LilunYu Shijian, 2015, 21(11): 1241-1244.

缺血性腦卒中有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類生命健康，一直以來(lái)是臨床研究的焦點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺血性腦卒中后，神經(jīng)血管的微環(huán)境改變可以誘導(dǎo)血管新生[1]。血管新生對(duì)腦卒中后期康復(fù)非常重要：新生的血管可為神經(jīng)發(fā)生提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并為新生的神經(jīng)細(xì)胞遷移到缺血周邊區(qū)域提供依附的支架，是梗死周邊區(qū)域腦組織抗損傷和神經(jīng)元修復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2-3]。但腦損傷誘發(fā)的血管新生過(guò)程短暫而微弱，不足以恢復(fù)神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)是血管新生過(guò)程中最重要的絲裂原，參與微血管滲透性，以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活[4-5]。有研究表明，缺血后VEGF的表達(dá)上調(diào)可以對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用，并且誘導(dǎo)血管新生[6]；VEGF誘導(dǎo)的血管新生可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[7]。

成纖維生長(zhǎng)因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)是較早發(fā)現(xiàn)的促血管新生因子之一，它能通過(guò)誘導(dǎo)VEGF合成，與VEGF和其他信號(hào)通路協(xié)同，促進(jìn)血管新生[8]。通過(guò)外源性藥物或其他手段提高缺血后VEGF與FGF-2的表達(dá)，將能更好地促進(jìn)缺血性腦損傷的神經(jīng)康復(fù)。

中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornusofficinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到單體化合物莫諾苷。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能減小局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，增強(qiáng)皮層抗氧化、抗炎和抗凋亡能力，并促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，改善神經(jīng)功能[9-13]。我們初步研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠促進(jìn)大鼠腦缺血后梗死灶周邊皮層區(qū)域血管密度增加。本研究探討莫諾苷對(duì)VEGF和FGF-2表達(dá)的影響，為莫諾苷促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCKK(京)2011-0004。飼養(yǎng)于宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(許可證號(hào)：SYXK(京)2010-0013)，環(huán)境溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，術(shù)前12 h禁食，不禁水。

1.2藥物

莫諾苷由宣武醫(yī)院藥物研究室自行從山茱萸中提取制備，高效液相色譜分析純度98.5%。使用前用蒸餾水溶解成所需濃度的藥液。

1.3試劑和儀器

兔源性VEGF多克隆抗體、鼠源性FGF-2單克隆抗體：美國(guó)SANTA CRUZ公司。鼠源性β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ECL Western Blotting Kit：美國(guó)THERMO-PIERCE公司。

JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎粉碎機(jī)：寧波市新芝科技研究所。Microfuge22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN COULTER公司。Powerpac Basic電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司。ImageStation 4000R高分辨率多模式分子成像系統(tǒng)：美國(guó)CARESTREAM HEALTH公司。Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMOFISHER公司。

1.4方法

1.4.1模型制備

參照Longa線栓法[14]制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后大鼠仰臥置于手術(shù)操作臺(tái)上，安爾碘頸部周圍消毒。頸正中切口2 cm，分離肌肉及筋膜，注意避開甲狀腺。暴露氣管右側(cè)及胸骨舌骨肌和胸鎖乳突肌之間的三角區(qū)，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈分叉處及頸總動(dòng)脈近心端，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈用眼科剪剪一個(gè)斜行細(xì)小切口，小心插入栓線，緩慢輕推栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到產(chǎn)生阻擋感，說(shuō)明栓線已經(jīng)經(jīng)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉處，通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈起始部。將栓線與頸內(nèi)動(dòng)脈一并結(jié)扎，松開動(dòng)脈夾，記錄開始時(shí)間?？p合肌肉，創(chuàng)口處涂少量青霉素，以預(yù)防傷口感染。30min后，用眼科鑷緩慢拔出栓線。

假手術(shù)組進(jìn)行相同手術(shù)操作，但不插栓線。

術(shù)后注意保溫，大鼠未醒前置于溫控毯上。

1.4.2分組與給藥

大鼠清醒后，參照Longa5分法行神經(jīng)功能損傷評(píng)分[15]：1分，提鼠尾離開地面約33 cm，不能充分伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，提鼠尾離開地面約33 cm，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分，將大鼠置于地面，向?qū)?cè)行走；4分，將大鼠置于地面，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，呈追尾狀；5分，損傷嚴(yán)重，對(duì)側(cè)肢體癱瘓。剔除1分和5分的大鼠。符合要求的動(dòng)物按評(píng)分高低，分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，每組3只。

莫諾苷溶于蒸餾水，造模后3 h按30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積蒸餾水。

1.4.3 Westernblotting

造模后7 d，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)?，取出患?cè)皮層包入錫箔紙中，液氮凍存片刻，-80℃保存。

取出患側(cè)皮層于5 ml EP管中稱重，加入預(yù)冷的裂解液7 μl/mg、PMSF 10 μl/ml裂解液，冰上充分超聲粉碎。4℃靜止30 min，4℃12000 r/min離心30 min，取上清。BCA法定量蛋白濃度，加入用裂解液，調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度一致?？偟鞍准尤?×上樣緩沖液1∶4稀釋，95℃變性10min。

VEGF和FGF-2采用10% SDS-PAGE分離膠，濃縮膠用5%SDS-PAGE。濃縮膠電壓60 V，40min，分離膠電壓90 V，90 min，電泳分離蛋白。0.45 μm NC膜轉(zhuǎn)膜；條帶在5%脫脂奶粉中封閉2 h；分別加兔多克隆VEGF抗體(1∶1000)、小鼠單克隆FGF-2抗體(1 ∶1000)和小鼠單克隆β-actin抗體(1∶1000)，4℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。Quanity One軟件分析蛋白條帶光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以(xˉ±s)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1VEGF

模型組VEGF蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組升高(P< 0.05)；與模型組相比，莫諾苷小、中、大劑量組VEGF蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2FGF-2

模型組FGF-2蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組升高(P< 0.05)；與模型組相比，莫諾苷大劑量組FGF-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表1　各組造模后患側(cè)皮層VEGF的表達(dá)

表2　各組造模后患側(cè)皮層VEGF的表達(dá)

3　討論

大腦缺血后的恢復(fù)是一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，包括早期損傷后應(yīng)激信號(hào)以及內(nèi)源性自我修復(fù)系統(tǒng)的激活。對(duì)缺血后血管新生分子機(jī)制的研究表明，在血管新生過(guò)程中最重要的階段是內(nèi)皮祖細(xì)胞激活，這對(duì)血管穩(wěn)態(tài)和修復(fù)至關(guān)重要[14-15]。

血管新生過(guò)程受血管生成因子VEGF/VEGFR系統(tǒng)調(diào)控。缺血后3 h，梗死側(cè)大腦VEGF表達(dá)開始升高，并且可持續(xù)7 d。VEGF可以通過(guò)上調(diào)Notch的配體Delta-like4(Dll4)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞芽生過(guò)程中的頂端細(xì)胞增殖；給予外源性VEGF可以促進(jìn)缺血半暗帶的血管新生，并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[16-18]。

FGF-2是潛在的促血管生成因子，可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和代謝活動(dòng)。Guo等證明，F(xiàn)GF-2能顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管芽生；刺激纖維蛋白酶和內(nèi)皮細(xì)胞膠原酶降解基底膜，使新生血管更容易向缺血區(qū)長(zhǎng)入；誘導(dǎo)新生毛細(xì)血管管腔形成，進(jìn)而增加卒中后缺血區(qū)域的腦血流量[19]。

本研究顯示，缺血性腦損傷能刺激促血管生成因子的生成，激活血管新生的分子機(jī)制，誘發(fā)血管新生；給予莫諾苷治療后，VEGF和FGF-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加，表明莫諾苷很可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF和FGF-2的表達(dá)，改善腦內(nèi)神經(jīng)血管微環(huán)境，促進(jìn)缺血性腦損傷后血管新生的修復(fù)過(guò)程。

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作者單位：1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京市100053；2.河北北方學(xué)院，河北張家口市075000；3.北京市腦重大疾病研究院，北京市100069。作者簡(jiǎn)介：郭德玉(1960- )，男，漢族，北京市人，副主任技師，主要研究方向：人類疾病動(dòng)物模型的制作。通訊作者：王文，男，博士，教授，研究員，主要研究方向：神經(jīng)藥理、中藥藥理。E-mail: lzwwang@163.com。

Effectsof Morronisideon Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Fibroblast Growth Factor-2 in Ratsafter Focal Cerebral Ischemia-reperfusion

GUO De-yu1, SUN Fang-ling1, WEI Ren-ping2, LIU Ting-ting1, CHENG hua1, AI Hou-xi1, TIAN Xin1, ZHU Zi-xin1, ZHENGWen-rong1, WANGYu-feng1, WANGWen1,3
1. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China; 2. Hebei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China; 3. Beijing Institutefor Brain Disorders, Beijing100069, China

Abstract:Objective To investigate the effects of morroniside on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) in rat cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion. Methods30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, morroniside-low group (30 mg/kg), morroniside-middle group (90 mg/kg) and morroniside-high group (270 mg/kg). Middle cerebral arteries of rats were occluded for 30 minutes with Longa's method and re-perfused. The expression of VEGF and FGF-2 in theischemic ipsilateral cortex wasdetected with Western blotting 7 daysafter reperfusion. ResultsTheexpression of both VEGF and FGF-2 increased in the ischemic ipsilateral cortexin in all the ischemic groups compared with the sham group (P<0.05). Theexpression of VEGF further increased in adose-dependent manner in all themorronisidegroupscompared with that of model group (P<0.05), and the expression of FGF-2 increased in the morroniside-high group (P<0.001). Conclusion Morroniside could increase theexpressionof VEGFand FGF-2after ischemia-reperfusion, whichmight promoteangiogenesis.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; morroniside; angiogenesis; vascular endothelial growth factor; fibroblast growth factor-2; rats

(收稿日期：2015-07-13修回日期：2015-09-06)

基金項(xiàng)目：1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX09102201-106)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81373994; No.81173575)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.001

[中圖分類號(hào)]R743.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2015)11-1241-04