錢靜，宓秀菊，劉樹青

音樂干預(yù)對孕期應(yīng)激仔鼠恐懼行為的影響及相關(guān)機(jī)制

錢靜1，宓秀菊2，劉樹青3

[摘要]目的研究音樂干預(yù)對孕期應(yīng)激仔鼠恐懼行為和杏仁核胃泌素釋放肽受體(GRPR)表達(dá)的影響。方法Wistar孕鼠16只隨機(jī)分為應(yīng)激組(n=8)和對照組(n=8)。應(yīng)激組妊娠11～20 d每天將其置于窄小的固定器中并給予強(qiáng)光照射。對照組不給予刺激。應(yīng)激組仔鼠出生后第1天起，予播放音樂(SM組)或相同分貝的白噪音(SW組)，SC組不給予刺激。生后60 d行防御退縮試驗(yàn)，免疫熒光組織化學(xué)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定杏仁核GRPR及其mRNA表達(dá)。結(jié)果與其他兩組比較，SM組仔鼠潛伏期顯著縮短(P< 0.001)，出小室次數(shù)顯著增多(P<0.001)；杏仁核GRPR陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.001)。結(jié)論生后給予音樂干預(yù)可以糾正孕期應(yīng)激仔鼠異常的恐懼行為，同時(shí)伴有杏仁核GRPR高表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]孕期應(yīng)激；音樂療法；胃泌素釋放肽受體；杏仁核；防御退縮試驗(yàn)；大鼠

[本文著錄格式]錢靜，宓秀菊，劉樹青.音樂干預(yù)對孕期應(yīng)激仔鼠恐懼行為的影響及相關(guān)機(jī)制[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015, 21(9): 1016-1019.

CITED AS: Qian J, Mi XJ, Liu SQ. Effect and mechanism of music exposure on fearful behavior of prenatal stressed rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1016-1019.

音樂可以改善人的焦慮、抑郁、煩躁等不良情緒，減輕疲勞及疼痛感，提高語言及認(rèn)知能力。音樂療法是應(yīng)用性較強(qiáng)的心理療法之一，它集音樂、醫(yī)學(xué)和心理學(xué)等多種學(xué)科的理論與實(shí)踐為一體，在保健和身心疾病的治療方面具有悠久的歷史[1-6]。

胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide, GRP)是一種應(yīng)激相關(guān)肽，其受體(GRPR)在下丘腦、杏仁核、海馬和新皮質(zhì)等應(yīng)激相關(guān)腦區(qū)廣泛分布[7]。研究發(fā)現(xiàn)，GRP對條件恐懼表達(dá)和消失密切相關(guān)，阻斷新生鼠的GRPR可導(dǎo)致恐懼記憶增強(qiáng)。束縛應(yīng)激可以刺激中央杏仁核GRP和促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素的釋放；該部位注射GRP可以抑制大鼠的攝食行為(一種應(yīng)激狀態(tài)表現(xiàn))，提示GRP在杏仁核對恐懼的調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用[8-12]。

孕期應(yīng)激仔鼠在曠場試驗(yàn)、防御退縮試驗(yàn)及高架十字迷宮試驗(yàn)中均表現(xiàn)出過多的恐懼行為，孕期應(yīng)激仔鼠已經(jīng)成為研究焦慮癥的成熟動(dòng)物模型[13-16]。本研究對孕期應(yīng)激仔鼠進(jìn)行音樂干預(yù)，觀察其對成年仔鼠恐懼行為及杏仁核GRPR表達(dá)的影響，以揭示音樂療法的生理機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組

Wistar孕鼠16只分為應(yīng)激組(n=8)和對照組(n= 8)。應(yīng)激組妊娠11～20 d每天置于窄小的固定器中，并予強(qiáng)光照射45 min，每天3次。對照組不給予刺激。仔鼠出生當(dāng)天將應(yīng)激組分為3組：SC組生后不給予刺激；SM組給予小提琴協(xié)奏曲《梁山伯與祝英臺(tái)》(55～65 dB) 45 min，每天2次[17]；SW組給予白噪音(55～65 dB) 45 min，每天2次。對照組仔鼠(CC組)不給予刺激。為了排除性別及窩別的影響，僅選擇雄性仔鼠，同窩仔鼠每組不超過2只，每組均為16只。

1.2防御退縮實(shí)驗(yàn)

生后60 d行防御退縮實(shí)驗(yàn)。自制木箱60×60×35 cm，一側(cè)連有15×20×15 cm的小室，兩者之間有活動(dòng)小門。60×60 cm曠場平均分為4×4個(gè)方格，光照強(qiáng)度75 lx；小室的光照強(qiáng)度<1 lx，為曠場折射的光線。

仔鼠測試前24 h在曠場適應(yīng)15 min，但不允許進(jìn)入小室。測試時(shí)先將其置于小室30 s，然后將小門打開。測試持續(xù)10 min，順序隨意。每次測試完畢均用稀釋的84消毒液擦拭曠場和小室，消除仔鼠的氣味。

2位測試人員通過監(jiān)控錄像對仔鼠進(jìn)行評定，測定進(jìn)入曠場的潛伏期、離開小室的次數(shù)、小室內(nèi)的時(shí)間(不包括潛伏期)、每分鐘跨越的方格線數(shù)。

1.3急性束縛應(yīng)激

采用有機(jī)玻璃大鼠束縛筒，每組取8只受試仔鼠置于束縛筒內(nèi)2 h，然后進(jìn)行防御退縮實(shí)驗(yàn)測試。另8只仔鼠直接測試。

1.4組織制備

行為學(xué)測試結(jié)束后，每組取8只麻醉后灌注，取腦，固定，沉糖，包被，切片，行免疫熒光染色。另8只斷頭處死，開顱取出杏仁核置于-80℃保存，行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。

1.5免疫熒光染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)

根據(jù)大鼠大腦圖譜，每組選擇基底外側(cè)核、中央核和外側(cè)核腦片計(jì)數(shù)GRPR陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6熒光實(shí)時(shí)定量PCR

提取經(jīng)過同質(zhì)加工處理后杏仁核的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成CDNA-20℃?zhèn)溆?。?yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR儀測定每個(gè)標(biāo)本的GRPR mRNA表達(dá)。計(jì)算2?ΔΔCt，以CC組表達(dá)水平為1，其他組以與CC組的比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用(xˉ±s)表示。行為學(xué)測試數(shù)據(jù)用2×4析因分析(廣義線性模型的單變量分析)；杏仁核各核團(tuán)GRPR陽性細(xì)胞數(shù)用隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析。組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，同組束縛與未束縛行為學(xué)指標(biāo)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1防御退縮實(shí)驗(yàn)

分組和束縛對潛伏期有交互影響(F=86.68, P< 0.001)。束縛可使CC、SC、SW組潛伏期延長(P< 0.05)，出小室次數(shù)減少(P<0.05)，延長SC和SW組在小室內(nèi)的時(shí)間(P<0.05)。但束縛應(yīng)激對SM組所有指標(biāo)均無影響。

方差分析顯示，無論有無束縛，各組潛伏期和出小室次數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)；在小室內(nèi)的時(shí)間束縛后各組間有非常高度顯著性差異(P<0.001)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，無論束縛與否，SM組均較CC組潛伏期短，出小室次數(shù)多；SC和SW組均較CC組出小室的次數(shù)減少，且束縛后潛伏期和在小室內(nèi)時(shí)間較CC組延長。各組仔鼠每分鐘穿越的線數(shù)無顯著性差異。見表1～表4。

表1　各組防御退縮實(shí)驗(yàn)潛伏期比較(s)

表2　各組防御退縮實(shí)驗(yàn)出小室次數(shù)比較(n)

表3　各組防御退縮實(shí)驗(yàn)在小室內(nèi)的時(shí)間比較(s)

表4　各組防御退縮實(shí)驗(yàn)每分鐘穿越的線數(shù)比較(n)

2.2杏仁核GRPR陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，組間(F=120.80, P<0.001)和核團(tuán)間(F=258.20, P<0.001)均有非常高度顯著性差異。兩兩比較，SM組GRPR陽性細(xì)胞數(shù)總數(shù)及各核團(tuán)GRPR陽性細(xì)胞數(shù)均顯著高于其他3組(P<0.001)，CC、SW、SC組間無顯著性差異(P>0.05)。見表5。

表5　各組不同核團(tuán)GRPR陽性細(xì)胞數(shù)總數(shù)比較(n)

2.3杏仁核GRPR mRNA的表達(dá)

SM組表達(dá)水平顯著升高為(98.17±24.93) (P< 0.001)，SW組(1.29±0.46)、SC組(1.13±0.26)較CC組無顯著性差異(P>0.05)。

3　討論

本研究顯示，孕期應(yīng)激可增加成年仔鼠防御退縮試驗(yàn)中的恐懼行為，束縛應(yīng)激可明顯加劇其恐懼表現(xiàn)；生后給予音樂干預(yù)則可糾正其異常表現(xiàn)，且伴有杏仁核GRPR表達(dá)水平增高。本文首次證實(shí)了音樂對大鼠杏仁核GRPR表達(dá)的影響。

音樂是一種放松和減壓的手段。Calcaterra等通過觀察兒外科術(shù)后患兒發(fā)現(xiàn)，音樂干預(yù)可緩解術(shù)后疼痛，并降低由于疼痛及焦慮所致的心率加快、血壓及血糖升高，還可提高血氧飽和度[2]。

目前已有研究證實(shí)人類音樂對動(dòng)物生理及心理的影響。Bowman等發(fā)現(xiàn)，聆聽古典音樂可以降低動(dòng)物救助中心寵物狗的心率變異率、唾液皮質(zhì)醇濃度，并改善其焦慮行為[18]。Howell等觀察到，音樂環(huán)境下被俘小猩猩的煩躁不安及易受激惹行為明顯減少[19]。王增賢等發(fā)現(xiàn)，在播放小提琴協(xié)奏曲《梁山伯與祝英臺(tái)》時(shí)，大鼠比較安靜并聚集在一起[17]?？梢娨魳穼?dòng)物具有一定的鎮(zhèn)靜作用，可以改善動(dòng)物的不良情緒和行為。我們的研究結(jié)果再次支持了這一觀點(diǎn)。

本研究顯示，接受音樂干預(yù)仔鼠杏仁核“恐懼回路”3個(gè)核團(tuán)的GRPR陽性細(xì)胞數(shù)均升高。GRP是一種蛙皮素樣肽，GRPR屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，位于細(xì)胞膜上，含有7個(gè)疏水跨膜區(qū)，由384個(gè)氨基酸構(gòu)成。GRP通過與GRPR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)，GRP對情緒記憶有明顯調(diào)節(jié)作用[20-21]。Shumyatsky等發(fā)現(xiàn)，GRPR表達(dá)于外側(cè)杏仁核的γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元，對下一級神經(jīng)元起抑制作用[10]。GRP可興奮這些中間神經(jīng)元，從而增強(qiáng)其對下級神經(jīng)元的抑制。GRPR基因敲除小鼠下級神經(jīng)元興奮性增高，長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)增強(qiáng)，從而使恐懼記憶加強(qiáng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，GRPR在杏仁核的中央核、基底外側(cè)核等核團(tuán)也有表達(dá)，γ-氨基丁酸能神經(jīng)元僅為表達(dá)GRPR細(xì)胞的一個(gè)亞群，提示GRPR參與了包括外側(cè)杏仁核在內(nèi)的多個(gè)核團(tuán)對恐懼記憶的調(diào)節(jié)[22]?；谶@一觀點(diǎn)，由于所有仔鼠在行為學(xué)測試前24 h都在曠場適應(yīng)15 min，半數(shù)仔鼠在試驗(yàn)前給予束縛應(yīng)激，這些刺激都可以構(gòu)成一種恐懼記憶。推測音樂組仔鼠GRPR高表達(dá)可能加強(qiáng)中間神經(jīng)元的抑制作用，降低下級神經(jīng)元的興奮性，從而使恐懼行為減少。

胚胎期各器官，包括消化道、肺、乳腺及神經(jīng)系統(tǒng)均有GRPR高表達(dá)，但出生后表達(dá)水平逐漸降低[23]。本研究顯示，音樂干預(yù)可使孕期應(yīng)激仔鼠杏仁核GRPR高表達(dá)，說明出生后給予音樂干預(yù)可以延緩杏仁核GRPR水平的下降。有研究顯示，音樂干預(yù)可使下丘腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)增多，神經(jīng)生長因子表達(dá)減少，提示音樂的生理效應(yīng)可能通過對神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響來調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺素軸的功能[24]。

目前已有研究為糖皮質(zhì)激素與GRPR受體系統(tǒng)在分子水平的相互作用提供了依據(jù)，如地塞米松可以提高人類肺癌細(xì)胞GRPR及其mRNA的表達(dá)，GRPR拮抗劑可阻斷地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖[25]。因此，音樂有可能通過對下丘腦-垂體-腎上腺素軸的調(diào)節(jié)使孕期應(yīng)激仔鼠杏仁核的GRPR高表達(dá)。有待進(jìn)一步研究。

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·基礎(chǔ)研究·

作者單位：1.北京兒童醫(yī)院集團(tuán)，聊城市兒童醫(yī)院兒童保健科，山東聊城市252000；2.聊城市人民醫(yī)院兒科，山東聊城市252000；3.北京兒童醫(yī)院集團(tuán)，貴陽市兒童醫(yī)院保健部，貴州貴陽市550003。作者簡介：錢靜(1968-)，女，漢族，江蘇張家港市人，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向：兒童保健。

Effect and Mechanism of Music Exposure on Fearful Behavior of Prenatal Stressed Rats

QIAN Jing1, MI Xiu-ju2, LIU Shu-qing3
1. Department of Child Care, Beijing Children's Hospital Medical Group, Liaocheng Children's Hospital，Liaocheng, Shandong 252000, China; 2. Department of Pediatrics, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng, Shandong 252000, China; 3. Department of Health Care, Beijing Children's Hospital Medical Group, Guiyang Children's Hospital, Guiyang, Guizhou 550003, China

Abstract:Objective To investigate the effect of postnatal music exposure on fearful behavior of prenatal stressed rats in defensive withdrawal test and the expression of gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) in the amygdala. Methods Wistar pregnant rats were divided in stress group (n=8) and control group (n=8). The stress group were immobilized and bright lighted 45 min, 3 times a day, when gestation 11-20 days, while the control group without any stress. The new born rats from the stress group were exposed in music (SM group) or white noise (SW group) for 45 min twice a day since 1 day after born, and the rats from the control (SC) group left undisturbed. They were tested with defensive withdrawal test 60 days after birth, and the GRPR levels in the amygdala were measured with immunofluorescence and real-time PCR. Results The latency was shorter and the frequence out of the chamber was the most in the SM group of the defensive withdrawal test (P<0.001), while GRPR-positive cells and GRPR mRNA increased in amygdala (P<0.001). Conclusion Postnatal music exposure can counteract the abnormal behavior response of prenatal stressed offspring and accompany with increased expression of GRPR in the amygdala.

Key words:prenatal stress; music exposure; gastrin-releasing peptide receptor; amygdala; defensive withdrawal test; rats

(收稿日期：2015-04-08修回日期：2015-06-23)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.007

[中圖分類號]R722.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1016-04