張亞洲，王 濤，宋 強(qiáng)，鄒樹(shù)良，朱金秋，劉海林

（1.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧 530000；3.西藏格創(chuàng)制藥有限公司，西藏拉薩 850000）

蝸牛酶促毛蕊異黃酮苷轉(zhuǎn)化成毛蕊異黃酮的條件研究*

張亞洲1，2，王 濤1，宋 強(qiáng)3，鄒樹(shù)良1，朱金秋1，劉海林1

（1.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西南寧 530000；3.西藏格創(chuàng)制藥有限公司，西藏拉薩 850000）

目的探討蝸牛酶酶解毛蕊異黃酮苷轉(zhuǎn)化生成毛蕊異黃酮的最佳轉(zhuǎn)化條件和方法。方法采用恒溫?fù)u床，將蝸牛酶溶于合適溫度的水中，加入用DMSO溶解的苷，邊加邊攪拌，加完后反應(yīng)30 min，最后用乙腈終止反應(yīng)。通過(guò)反復(fù)重結(jié)晶得到所需要的苷元。結(jié)果最佳轉(zhuǎn)化條件為，當(dāng)蝸牛酶與毛蕊異黃酮苷的比例為1∶2時(shí)，加入200 mL的保溫35～37℃水中，待蝸牛酶溶解均勻后，再加入毛蕊異黃酮苷（溶于1 mL的DMSO中），pH維持5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。結(jié)論該法能有效使毛蕊異黃酮苷轉(zhuǎn)化為純度大于98%的毛蕊異黃酮，方法簡(jiǎn)單，易于操作。

蝸牛酶；毛蕊異黃酮苷；毛蕊異黃酮；轉(zhuǎn)化

毛蕊異黃酮是來(lái)源于蒙古黃芪 Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao中有雌激素樣作用的異黃酮類(lèi)活性化合物，在其中含量最高，也一直是藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中提取物制備的混合酶[2-4]，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種，是一種 β-D-葡萄糖水解酶，能有效水解 β-D-葡萄糖結(jié)合的糖苷，從而制備糖上連接的相應(yīng)苷元[5-6]。筆者對(duì)蝸牛酶水解毛蕊異黃酮苷去掉7位葡萄糖后制備毛蕊異黃酮的方法進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

DIONEX ultimate 3000型高效液相色譜儀；恒溫水浴鍋（江蘇常州順華儀器設(shè)備有限公司）。水為純水；乙腈（天津市西華特種試劑廠(chǎng)，批號(hào)為20120911）均為分析純，甲醇（天津市西華特種試劑廠(chǎng)，批號(hào)為20120911），蝸牛酶（上海源葉生物技術(shù)有限公司）。毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮(四川維克奇試劑有限公司，批號(hào)分別為20100327，20100523)含量均大于99.5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定條件

色譜柱：菲羅門(mén)C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相[7-8]：乙腈-水(25∶75)。2.2 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)選

孵化溶液與用量：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入100，200， 300 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果加入的水量沒(méi)有較明顯的影響。

圖1 高效液相色譜圖

孵化中蝸牛酶與毛蕊異黃酮的用量比例：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷 200，300，400，500 mg（溶于 1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)酶與毛蕊異黃酮苷比例(酶∶藥)小于2時(shí)，轉(zhuǎn)化率（A/mg）相差不大(RSD=0.25%)。

表1 蝸牛酶在不同體積的水中轉(zhuǎn)化情況

表2 不同比例的毛蕊異黃酮苷和蝸牛酶的轉(zhuǎn)化情況

孵化時(shí)間：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫（37±0.2）℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5，1，1.5 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表3。孵化時(shí)間在30 min后2 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率沒(méi)有差異。

表3 不同孵化時(shí)間毛蕊異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況

孵化時(shí)溫度：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(35±0.2)℃、(37±0.2)℃、(39±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表4。孵化時(shí)溫度35～37℃時(shí)的轉(zhuǎn)化效果較好。

表4 不同孵化溫度對(duì)毛蕊異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況

孵化時(shí)pH：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(37±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），設(shè)立孵化時(shí) pH為5.0，6.0，7.0，8.0，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表5。孵化時(shí)pH在5～8時(shí)的轉(zhuǎn)化效果較好。

表5 不同孵化時(shí)pH對(duì)毛蕊異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況

酶解終止溶劑：稱(chēng)取200 mg的蝸牛酶，分別加入200 mL的保溫(37±0.2)℃水中，溶解均勻后，再分別加入毛蕊異黃酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，分別用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等量終止反應(yīng)。超聲后搖勻后取樣，微孔濾膜過(guò)濾，20 μL進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表6。不同孵化的終止溶劑甲醇與乙腈對(duì)毛蕊異黃酮苷轉(zhuǎn)化情況的影響較小。

表6 不同孵化的終止劑對(duì)毛蕊異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況

2.3 酶解反應(yīng)條件確定

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，用蝸牛酶水解毛蕊異黃酮苷得到毛蕊異黃酮時(shí)，稱(chēng)取 1份蝸牛酶，分別加入 100倍的保溫35～37℃水中，待蝸牛酶溶解均勻后，再分別加入的毛蕊異黃酮苷（2倍量蝸牛酶以下，溶于1 mL的 DMSO中），pH維持在5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量終止反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表7。3次試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化率均大于98%，結(jié)果較穩(wěn)定（RSD=0.14%），均達(dá)到了要求，可以用來(lái)制備高純度的毛蕊異黃酮（含量＞98%）。

表7 3次不同試驗(yàn)中毛蕊異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況

3 討論

自然界植物中所含苷以β-D-葡萄糖苷形成的苷元為主，β-D-葡萄糖苷占植物中分離所得苷的90%以上，新鮮植物中苷的含量一般大于對(duì)應(yīng)的苷元[9]。由于苷在口服后均經(jīng)腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化為苷元而吸收，故在進(jìn)行研究時(shí)一般多采用苷元[10]。

蝸牛酶是一種具有專(zhuān)屬性的β-D-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化酶。蝸牛酶酶解反應(yīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境不產(chǎn)生污染，轉(zhuǎn)化體系中的水用純凈水或自來(lái)水的影響較小；再者，酶解反應(yīng)具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、要求簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，可成為工業(yè)中應(yīng)用的一個(gè)理想選擇[2，4]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化時(shí) pH在5～7時(shí)轉(zhuǎn)化效果較好；溫度控制在35～37℃時(shí)孵化，轉(zhuǎn)化效果較好；轉(zhuǎn)化速度較快，均可在30 min后既可達(dá)到平衡。本研究為水解β-D-葡萄糖苷提供了方法和借鑒，方法與設(shè)備簡(jiǎn)單，且易操作，是一種進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)化的實(shí)用、可行的優(yōu)良方法。

[1]張亞洲，徐 風(fēng)，梁 靜，等.蒙古黃芪中異黃酮類(lèi)化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(21)：3 243-3 247.

[2]盧艷花.天然藥物的生物轉(zhuǎn)化[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：75.

[3]惠 軍，吳 焱，祝長(zhǎng)青，等.新疆蝸牛酶的研制[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(3)：90-92.

[4]鄔曉勇，何 鋼，孫雁霞，等.蝸牛酶中纖維素酶的分級(jí)分離[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(4)：1 394-1 396.

[5]胡英杰，樊蘊(yùn)華，肖敏勛，等.蝸牛酶水解牛芬子昔制備昔元的研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21(6)：473-475.

[6]賈東升，賈曉斌，薛 .蝸牛酶轉(zhuǎn)化淫羊藿苷制備淫羊藿苷元的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35(7)：857-860.

[7]黃月純，尹 雪，魏 剛，等.玉屏風(fēng)煎劑不同配伍對(duì)毛蕊異黃酮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的影響[J].中國(guó)藥房，2010，21(6)：621-623.

[8]薛改進(jìn)，趙云麗，郝 杰，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定抗敏顆粒中芍藥苷、毛蕊異黃酮苷和阿魏酸的含量[J].中國(guó)藥房，2010，21(23)：2168-2170.

[9]Sun JM，Sun BL，Han FX，et al.Rapid HPLC method for determination of 12 isoflavone components in soybean seeds.Agr[J].Sci，China，2011，10(1)：70-77.

[10]Yang SQ，Wang LJ，Yan QJ，et al.Hydrolysis of soybean isoflavone glycosides by a thermostable β-glucosidase from Paecilomyces thermophila[J].Food Chem，2009，115(4)：1 247-1 252.

Calycosin-7-O-β-D-Glucoside Transformation into Calycosin by Incubation with the Snailase

Zhang Yazhou1,2，Wang Tao1，Song Qiang3,Zou Shuliang1，Zhu Jinqiu1,Liu Hailin1
(1 Guizhou Institute of Technology,Guiyang,Guizhou,China 550003; 2 Guangxi Medicinal Botanical Garden,Nanning,Guangxi,China 530000; 3.Xizang Gechuang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Lasa,Xizang,China 850000)

Objective To study the best best conditions and methods to conduct the transformation of calycosin-7-O-β-D-glucoside into calycosin using the enzymatic hydrolysis with snailase.M ethods The snailase was dissolved in a suitable water in constant temperature shaking table and then added dimethyl sulfoxide(DMSO)which calycosin-7-O-β-D-glucoside was dissolved in,kept the reaction for 30 min,and finally terminated the reaction with acetonitrile.Results When the snailase and calycosin-7-O-β-D-glucoside were in the ratio of 1∶2,added with 200 mL water(keeping in 35-37℃),added calycosin-7-O-β-D-glucoside that was dissolved in 1 mL of DMSO,and the pH was maintained at between 5-8,then quenched with an equal amount of acetonitrile after incubating 0.5 h.Conclusion This method can easily transform the calycosin-7-O-β-D-glucose into calycosin(＞98%),and the operating process is simple and effective.

snailase;calycosin-7-O-β-D-glucoside;calycosin

R284；R282.71

A

1006-4931(2015)19-0021-03

張亞洲（1980-），男，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锏幕钚猿煞职l(fā)現(xiàn)和代謝研究，(電話(huà))0851-88210721（電子信箱）zhangyazhou＠git.edu.cn。

2015-04-09)

*廣西自然科學(xué)基金（黃芪皂苷Ⅳ，Ⅱ及其苷元環(huán)黃芪醇的代謝研究），項(xiàng)目編號(hào)：2013GXNSFBAO19187；貴州理工學(xué)院項(xiàng)目（山豆根中的主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)有效物質(zhì)形式研究)，項(xiàng)目編號(hào)：XJGC20141106。