趙明霞，魯曉蓉，張俊東，劉勝利，王界永，魏 偉

新型蒽環(huán)類衍生物HYY-014大鼠體內(nèi)藥代動力學和組織分布的研究

趙明霞1，2，3，魯曉蓉3，張俊東2，劉勝利2，王界永2，魏 偉1

摘要目的 研究新型蒽環(huán)類衍生物HYY-014在大鼠體內(nèi)的藥代動力學和組織分布特征，為臨床研究提供實驗依據(jù)。方法 大鼠單次尾靜脈注射1.5 mg／kg的HYY-014后，采用LC-MS／MS法測定各時間點血漿和組織中HYY-014及其代謝物HYY-M3的濃度，藥代動力學參數(shù)經(jīng)DAS 3.0統(tǒng)計軟件計算獲得。結(jié)果 采用統(tǒng)計矩方法處理藥物濃度時間數(shù)據(jù)，HYY-014藥代動力學參數(shù)Cmax、T1／2、Vd、CL、AUC0-t、MRT0-t分別為（1 628.6±618.6）μg／L、（24.4±3.6）h、（23.4± 5.2）L／kg、（0.66±0.08）L／kg／h、（2 219.5±276.9）μg／L ·h、（15.1±2.4）h；HYY-M3藥代動力學參數(shù)Cmax、AUC0-t分別為（2.2±0.6）μg／L、（103.1±13.7）μg／L·h。靜脈注射該藥后，很快向機體的各組織廣泛分布，且具有明顯的靶向性，主要分布在脾、腎、肺、心臟、肝等組織，腦組織中濃度極低。結(jié)論 靜脈注射HYY-014組織分布廣泛，具有明顯的靶向性，肺、肝組織中的藥物濃度均較高，不能通過血腦屏障。

關(guān)鍵詞HYY-014；蒽環(huán)類衍生物；藥代動力學；組織分布；大鼠；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜

2014－12－26接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥230032

2合肥合源醫(yī)藥科技股份有限公司、3合肥合源藥業(yè)有限公司，合肥 230031

蒽環(huán)類藥物自20世紀70年代問世以來，因療效較好、抗腫瘤譜較廣，已成為臨床上有效的抗腫瘤藥物之一，是治療各種血液性腫瘤（淋巴瘤、白血病等）和實體瘤（乳腺癌、卵巢癌、肉瘤等）的一線化療藥物［1－3］。HYY-014為新一代具有二糖配基的蒽環(huán)類衍生物，該化合物設(shè)計原理：改變環(huán)類抗生素糖基鏈長度和種類，提高藥物糖基與DNA雙螺旋小溝間的結(jié)合位點，從而增加藥物-DNA-拓撲異構(gòu)酶形成的三元復(fù)合物的穩(wěn)定性和選擇性。另外分子中含有的氨基基團還可伸出DNA雙螺旋的小溝并與另一DNA鏈或拓撲異構(gòu)酶Ⅱ結(jié)合。HYY-014相對于其他蒽環(huán)類抗生素的優(yōu)勢已在多種腫瘤細胞系體外試驗和多種人類腫瘤異種移植荷瘤裸鼠的體內(nèi)實驗中得到證實。本課題組前期試驗結(jié)果顯示，HYY-014以原形代謝為主，半衰期短于多柔比星和表柔比星，已知C13醇毒性代謝產(chǎn)物顯著低于多柔比星，表現(xiàn)為更好的安全性，且與順鉑聯(lián)合使用毒性不疊加，而藥效有協(xié)同作用。該研究參照《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則》［4］要求，通過LC-MS／MS法觀察HYY-014在大鼠體內(nèi)藥代動力學及組織分布情況，以了解HYY-014在大鼠體內(nèi)吸收、分布規(guī)律，為其進一步研究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 SD大鼠，SPF級，180～280 g，共72只，雌雄各半，購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司。

1．2 儀器與試劑 Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX型LC-MS／MS（美國Thermo公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；XS105分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；Milli-Q Academic純水機（上海密理博貿(mào)易有限公司）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HGC-24型氮吹儀（北京瑞邦興業(yè)科技有限公司）；16K平衡離心機（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）。

HYY-014原料藥（批號：20110704，含量：93.9%）、HYY-014標準品（批號：20110502，含量：97.95%）、代謝物HYY-M3（批號：20110523，含量：88.00%）均購自合肥合源藥業(yè)有限公司；鹽酸多柔比星（批號：130509－200301，含量：97.4%）由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；二氯甲烷（分析純）購自天津博迪化工股份有限公司；水為自制純化水。

1．3 方法

1．3．1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱（Phe-

nomenex Luna 5 μ C18150 mm×2.0 mm柱）、流動相（乙腈∶水（含0.1%甲酸）＝28∶72）、流速0.2 ml／min、柱溫40℃、進樣量10 μl。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源；正離子方式檢測，電噴霧電壓為4．7 kV；加熱毛細管溫度為320℃；源CID為－8 V；鞘氣（N2）壓力為30 Arb；輔氣（N2）壓力為3 Arb；碰撞氣（Ar）壓力為1．0；掃描時間均為0.5 s；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測。用于定量的離子分別為HYY-014 m／z：母離子644.0、子離子331.0、碰撞能33 eV；HYY-M3 m／z：母離子646.0，子離子332.7，碰撞能27 eV；內(nèi)標物多柔比星m／z：母離子544.0、子離子396.8，碰撞能15 eV。

1．3．2 HYY-014原料藥的配制 稱取所需量的HYY-014原料藥于滅菌后的容器中，用5%葡萄糖注射液溶解成0．30 mg／ml溶液，并用0.22 μm過濾膜過濾殺菌。

1．3．3 藥代動力學研究 根據(jù)課題組HYY-014前期藥效學研究及預(yù)試驗結(jié)果，選擇8只大鼠，雌雄各半，經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢推注1.5 mg／kg HYY-014，分別于給藥前（0）和給藥后5、15、30 min、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96 h從眼眶后靜脈叢取血約0.2 ml置于肝素抗凝管，3 000 r／min離心15 min后分離血漿。

1．3．4 組織分布研究 取64只大鼠隨機均等分成8組，雌雄各半，經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢推注1.5 mg／kg HYY-014，分別于給藥前（0）和給藥后5 min、1、4、10、24、72、120 h處死動物，取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、腦、小腸、肌肉、脂肪、皮膚、骨骼、睪丸（卵巢）等組織，用濾紙吸干組織表面血液，剪取稱重約0．5 g，剪碎后按照1∶4（w∶v）的比例，加入生理鹽水，制成勻漿液，－70℃冷凍保存待測。

1．3．5 樣品處理方法 精密吸取10 μl內(nèi)標物多柔比星溶液（86.4 μg／L）加入空白離心管中，加入一定體積的組織勻漿液（血漿取50 μl，胃、肝、脾、肺、睪丸、心臟、腎臟、卵巢取300 μl，脂肪、肌肉、骨骼取1 000 μl，皮膚、小腸、腦取2 000 μl），渦旋1 min，加入混合提取液（二氯甲烷∶甲醇＝9∶1），渦旋3 min，14 000 r／min離心10 min，提取有機層，N2下吹干，100 μl復(fù)溶液（甲醇∶水＝50∶50），10 μl進樣分析。

1．4 統(tǒng)計學處理 標準曲線采用線性回歸分析，藥代動力學參數(shù)采用DAS 3．0軟件計算。

2 結(jié)果

2．1 方法學驗證

2．1．1 專屬性 取空白血漿／組織勻漿液，除不加內(nèi)標外，按1．3．5項下操作，獲得空白樣品色譜圖。將一定濃度HYY-014、HYY-M3標準溶液和內(nèi)標溶液加入大鼠空白血漿／組織勻漿液中，同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖；同法得到大鼠給藥后血漿樣品及組織樣品色譜圖。HYY-014保留時間為3.9 min，代謝物HYY-M3保留時間為2.8 min，內(nèi)標物多柔比星保留時間為2.6 min。在色譜條件下，大鼠組織勻漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾HYY-014、代謝物HYYM3及內(nèi)標的測定。心臟組織典型色譜圖見圖1，血漿及其他組織與代表性組織的色譜圖相同。

2．1．2 標準曲線 精密吸取不同濃度的HYY-014、HYY-M3標準溶液及內(nèi)標工作液各10 μl，加入不同體積空白血漿／組織勻漿液，混勻，按1．3．5項下方法處理制備標準曲線。以血漿／組織濃度（X）為橫坐標，以樣品峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（Y）作為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法（W＝1／X2）進行線性回歸，結(jié)果顯示HYY-014及其代謝物HYY-M3線性關(guān)系均良好，r≥0.99。見表1。

表1　大鼠血漿／各組織中HYY-014及HYY-M3的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2．1．3 精密度 按1．3．5項下方法處理制備高、中、低3個濃度的HYY-014、HYY-M3樣品，平行操作6份，于同1 d內(nèi)測定3次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。HYY-014、HYY-M3日內(nèi)精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為3.12%～9.98%、3.23%～10.09%；日間精密度RSD分別為6.49%～8.84%、6.50%～8.48%，符合要求。

2．1．4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按1.3．5項下方法處理制備高、中、低3個濃度的HYY-014、HYYM3樣品，平行操作3份，以處理后的樣品色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)處理的樣品色譜峰面積之比，考察方法的提取回收率；以空白血漿處理后再加入標準溶液所得色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)處理的樣品色譜峰面積之比考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示HYY-014、HYY-M3及內(nèi)標提取回收率分別為71.06%～90.99%、55.23%～67.44%、82.79%～92.07%，基質(zhì)效應(yīng)分別為96.62%～109.24%、92.78%～115.27%、89.65%～108.10%；RSD值均小于12%，符合要求。

2．1．5 穩(wěn)定性 按1．3．5項下方法處理制備高、中、低3個濃度的HYY-014、HYY-M3樣品，平行操作，分別考察在室溫放置6 h、室溫放置7 h再處理、4℃放置23 h、反復(fù)凍融3次、長期冷凍33 d條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示RSD值均小于10%，樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2．2 大鼠藥代動力學研究 大鼠靜脈注射HYY-014后，HYY-014、HYY-M3血藥濃度用DAS 3.0軟件采用統(tǒng)計矩方法統(tǒng)計相應(yīng)藥代動力學參數(shù)。見圖2、表2。

2．3 大鼠體內(nèi)組織分布研究 靜脈給予HYY-014

后，該藥可很快向機體的各組織廣泛分布。5 min時，組織中HYY-014濃度依次為：脾＞腎＞肺＞小腸＞心臟＞卵巢＞肝＞胃＞骨骼＞肌肉＞脂肪＞皮膚＞睪丸＞腦，其中脾、腎、肺等器官達到最高；1～24 h后各器官濃度均下降（除小腸、肌肉和脂肪外），脾、腎、肺濃度均降低較少；72～120 h后，各器官濃度趨于平穩(wěn)，但仍舊能夠檢測到，120 h后脾和肺中的濃度較高。皮膚、睪丸、腦均分布較低。HYY-M3在組織分布中從5 min～10 h逐漸升高，5 min時脾、骨髓、肌肉、血漿和腦中均未檢測到HYYM3，大部分組織在10 h或24 h時達到最高濃度，而后逐漸降低，在120 h后仍可檢測到。見圖3、4。

表2　大鼠靜脈注射1．5 mg／kg HYY-014后藥代動力學參數(shù)（n＝8，±s）

表2　大鼠靜脈注射1．5 mg／kg HYY-014后藥代動力學參數(shù)（n＝8，±s）

參數(shù)HYY-014　HYY-M3 AUC0－t（μg／L·h）2 219．50±276．90　103．1±13．7 Cmax（μg／L）　1 628．60±618．60　2．2±0．6 T1／2（h）　24．40±3．60　　－MRT0－t（h）　15．10±2．40　?。瑿L（L／kg／h）　0．66±0．08　?。璙d（L／kg）23．40±5．20　?。?/p>

3 討論

在新藥研發(fā)過程中，藥物在吸收、分布、代謝和消除過程中具有良好的藥代動力學性質(zhì)和較低的毒副作用是候選藥物通過臨床試驗的關(guān)鍵。由于吸收率、穩(wěn)定性、不良反應(yīng)等原因被淘汰的藥物占到新藥開發(fā)的50%［5］。研究藥物的組織分布特點，有助于了解藥物作用的靶器官，預(yù)測藥物的藥理作用，對擴大藥物的臨床用途有重要意義；組織分布研究還提供了藥物的可能蓄積部位及其程度，對于預(yù)測藥物不良反應(yīng)有重要價值。

在蒽環(huán)類抗生素中，多柔比星為最具代表性的藥物，目前已在臨床中用于多種腫瘤疾病的治療。然而骨髓毒性、劑量依賴性累積心臟毒性和耐藥性的出現(xiàn)會限制蒽環(huán)類抗生素藥物的使用。過去的25年中人們?yōu)殚_發(fā)新的高效、低毒蒽環(huán)類抗生素藥物付出了巨大的努力。自多柔比星發(fā)現(xiàn)以來，為拓展多柔比星的抗腫瘤譜和突破其毒性限制，已有超過2 000種結(jié)構(gòu)類似物被合成和開發(fā)。第二代蒽環(huán)類抗生素藥物表柔比星和依達比星已應(yīng)用于臨床，前者降低了心臟毒性，因此可以使用更高累積劑量；后者則使藥物針對血液學惡性腫瘤具有更強大的藥理活性。降低藥物毒性及增加對腫瘤的選擇性成為蒽環(huán)類抗生素藥物開發(fā)的主要方向。

本研究結(jié)果表明，靜脈注射HYY-014后，大鼠體內(nèi)主要以原形代謝為主，血漿中消除半衰期較短，血藥濃度較高，結(jié)合課題組其他試驗結(jié)果顯示，HYY-014具有良好的藥代動力學特征，在治療濃度

范圍呈線性特征，較其他類似物有更高的濃度和較短的半衰期；該藥物在組織中的分布較廣泛，具有一定的靶向性，主要分布在脾、腎、肺、心臟、肝等組織，其中腦組織濃度極低，提示該藥不易通過血腦屏障。其分布特征提示了其抗腫瘤活性具有組織選擇性，HYY-014在肺臟具有較高濃度，臨床前藥效學研究已表明該藥對小細胞肺癌療效均優(yōu)于多柔比星。毒性代謝產(chǎn)物HYY-M3在組織中的濃度較低，特別是在心臟組織濃度較低，提示HYY-014可能較其他蒽環(huán)類抗生素類似物心臟毒性低。

蒽環(huán)類同類型抗腫瘤藥物多柔比星等檢測多采用熒光法［6－9］，在檢測限方面有一定局限性。本研究采用LC-MS／MS測定血漿／組織濃度，靈敏度高，最低檢測濃度可至0．031 μg／L。文獻［9］中生物樣品預(yù)處理方法多使用大體積的氯仿、氯仿－甲醇混合液提取，或者使用固相萃取法，氯仿不僅毒性大且萃取過程中容易發(fā)生乳化，固相萃取柱價格昂貴，成本高。本研究采用二氯甲烷和甲醇混合物萃取，降低了有機試劑的毒性和用量。

參考文獻

［1］ 韓 崇，朱 雄，徐云根．蒽環(huán)類抗腫瘤化合物的研究進展［J］．中國新藥雜志，2013，22（3）：307－12．

［2］ Ding Q，Zhan J．Amrubicin：potential in combination with cisplatin or carboplatin to treat small-cell lung cancer［J］．Drug Des Devel Ther，2013（7）：681－9．

［3］ Zhou Z Y，Wan L L，Yang Q J，et al．Evaluation of the pharmacokinetics and cardiotoxicity of doxorubicin in rat receiving nilotinib ［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2013，272（1）：238－44．

［4］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局．化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則［H］GPT5-1．2005－03．

［5］ 王 琳，陳 涵．藥物體外吸收、分布、代謝和排泄篩選模型［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（50）：9957－61．

［6］ 孫習鵬，萬麗麗，徐志儒，等．高效液相色譜法測定大鼠血漿及組織中多柔比星含量［J］．中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2010，7 （4）：211－5．

［7］ Huan M，Tian S，Cui H，et al．Deposition of doxorubicin in rats following administration of three newly synthesized doxorubicin conjugates［J］．Biomed Res Int，2013，2013：926584．

［8］ 秦 燕，徐智儒，王向偉，等．PEG化脂質(zhì)體多柔比星在動物體內(nèi)的藥動學及組織分布［J］．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40 （8）：596－9．

［9］ 藍曉紅，李 祥，許 銳，等．高效液相－熒光檢測法測定兔血漿中表柔比星的藥動學研究［J］．解放軍藥學學報，2010，26（6）：503－5．

Pharmacokinetic and tissue distribution studies of HYY-014，a novel derivate of anthracycline

Zhao Mingxia1，2，3，Lu Xiaorong3，Zhang Jundong2，et al
（1Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Hefei Cosource Medicine Technology Co．，Ltd，3Hefei Cosource Pharmaceuticals Co．Ltd，Hefei 230031）

AbstractObjective To study the pharmacokinetics and tissue distribution on HYY-014，a novel derivate anthracycline．Methods The plasma and tissues concentrations of HYY-014 and HYY-M3 were detected by LC-MS／MS method after intravenous administration of 1．5 mg／kg HYY-014．The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 3．0．Results The concentration-time data were analyzed by statistical moment principle．The pharmacokinetic parameters Cmax，T1／2，V，CL，AUC0-tand MRT0-tof HYY-014 were（1 628.6±618.6）μg／L，（24.4±3.6）h，（23.4±5.2）L／kg，（0.66±0.08）L／kg／h，（2 219.5±276.9）μg／L·h，（15.1±2.4）h．The pharmacokinetic parameters Cmaxand AUC0-tof HYY-M3 were（2.2±0.6）μg／L，（103.1±13.7）μg／L ·h．After administrated intravenously，HYY-014 was quickly distributed to the body widely，the target organs were spleen，kidney，lung，heart and liver．The concentration of the brain was very low．Conclusion The distribution of HYY-014 is higher in lung and liver after administrated intravenously．It can’t permeate blood brain barrier．

Key wordsHYY-014；anthracycline；pharmacokinetics；tissue distribution；rats；LC-MS／MS

作者簡介：趙明霞，女，碩士研究生；魏 偉，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家十二五“重大新藥創(chuàng)新”科技重大專項資助，企業(yè)創(chuàng)新藥物孵化基地建設(shè)課題（編號：2011ZX09401-021）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0472－05

中圖分類號R 969．1