丁 婧，李 榮，胡向陽，蔡 莉，張曉亮，汪 巧

環(huán)巴胺對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖凋亡的影響及其抗凋亡機(jī)制

丁 婧1，李 榮2，胡向陽1，蔡 莉1，張曉亮3，汪 巧1

摘要目的 研究Hedgehog（Hh）信號(hào)通路阻斷劑環(huán)巴胺對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖凋亡的影響及抗凋亡機(jī)制。方法 弗氏完全佐劑誘導(dǎo)AIA大鼠模型，胰酶－膠原酶法分離培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，環(huán)巴胺體外給藥處理AIA軟骨細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，DNA電泳、Hoechst染色、Annexin V-FITC／PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，RT-PCR檢測(cè)Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 環(huán)巴胺（0．08、0．4、2、10、50 μmol／L）劑量依賴性地提高AIA軟骨細(xì)胞增殖。AIA組可見凋亡細(xì)胞DNA梯狀條帶，環(huán)巴胺（0．4、2、10 μmol／L）給藥組的梯狀條帶明顯減少；AIA組存在核碎裂與染色質(zhì)固縮，環(huán)巴胺給藥組均勻藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)量增多；流式分析結(jié)果表明AIA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高，環(huán)巴胺明顯減少細(xì)胞凋亡率；與正常組相比，AIA組軟骨細(xì)胞中Hh信號(hào)通路相關(guān)基因（Shh、Ptch1、Gli1）mRNA表達(dá)顯著升高，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下降，而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高。環(huán)巴胺體外給藥能抑制Hh信號(hào)通路過度活化，提高Bcl-2 mRNA表達(dá)，并降低Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)。結(jié)論 環(huán)巴胺體外給藥能促進(jìn)AIA軟骨細(xì)胞的增殖，并抑制AIA軟骨細(xì)胞的過度凋亡；該抗凋亡作用和調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)密切相關(guān)，提示干預(yù)軟骨細(xì)胞Hh信號(hào)通路對(duì)保護(hù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨具有潛在的治療意義。

關(guān)鍵詞Hedgehog信號(hào)通路；環(huán)巴胺；佐劑性關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；增殖；凋亡

2014－12－13接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)1病理學(xué)教研室、2藥學(xué)院，合肥 230032

3安徽省立醫(yī)院病理科，合肥 230032

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性炎癥性疾病，以滑膜慢性炎癥為特點(diǎn)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織的破壞［1］。軟骨損傷與RA嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)，保護(hù)軟骨功能、遏止軟骨破壞，能阻逆RA病理進(jìn)程、降低RA致殘率［2－3］。既往Hedgehog（Hh）信號(hào)通路的研究［4－5］集中在胚胎期組織分化發(fā)育調(diào)節(jié)及腫瘤形成機(jī)制，該通路在軟骨細(xì)胞的增殖和分化、骨形成與骨代謝等生理和病理過程中亦發(fā)揮復(fù)雜調(diào)控作用。研究［6－7］表明Hh信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨中異常激活，與OA軟骨破壞程度密切相關(guān)，抑制該通路能明顯緩解病情。RA與OA具有相似的軟骨病理變化和臨床癥狀，抑制Hh信號(hào)通路能否用于RA治療的類似研究至今未見報(bào)道。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）的病理過程和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與RA相似，是研究RA發(fā)病機(jī)制和篩選RA治療藥物的經(jīng)典動(dòng)物模型。該研究以AIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Hh信號(hào)通路阻斷劑環(huán)巴胺體外給藥對(duì)其增殖凋亡的影響及可能機(jī)制，為防治RA尤其是保護(hù)RA關(guān)節(jié)軟骨提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，180～200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

1．2 藥物與試劑 環(huán)巴胺（美國LC實(shí)驗(yàn)室）；弗氏完全佐劑（美國Chondrex公司）；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、DNA抽提試劑盒、Hoechst 33342染色液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司）；PCR試劑盒（美國Promege公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

參考文獻(xiàn)1．3 大鼠AIA模型制備［8］方法，右后足趾皮內(nèi)注射0．1 ml弗氏完全佐劑致炎作為AIA大鼠，注射同體積的生理鹽水作為正常大鼠。 1．4 胰酶－膠原酶法分離培養(yǎng)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及鑒定［9］方法，分離大鼠關(guān)節(jié)表面軟骨，37℃胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶分別消化40 min 和3 h。200目濾網(wǎng)過濾收集消化液，1 500 r／min離心10 min，PBS清洗，共3次。收集細(xì)胞，加入含

10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打均勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48 h后換液除去未貼壁細(xì)胞，當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞連成片時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為傳1～3代的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并采用Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色和甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。

1．5 MTT法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖反應(yīng) 收集對(duì)數(shù)增殖期的AIA軟骨細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以2 ×108／L的細(xì)胞密度接種于96孔板，分7組：正常組（正常大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞）、AIA組（AIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞未給予藥物刺激）、環(huán)巴胺0.08、0.4、2、10、50 μmol／L給藥組（AIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞加入5組不同濃度的環(huán)巴胺）。每孔100 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)液，各給藥組再加入含不同濃度環(huán)巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）的完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)44 h，7組均加入MTT（5 g／L）10 μl／孔，孵育4 h，加入Formanzan溶解液100 μl／孔，光學(xué)顯微鏡下觀察Formanzan全部溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度（absorbance，A）值A(chǔ)570。

1．6 DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以2×108／L的密度接種于24孔板，分4組：AIA組、環(huán)巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組。每孔1 ml，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，加入含不同濃度環(huán)巴胺（0.4、2、10 μmol／L）的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，1 500 r／min離心10 min，收集細(xì)胞。按試劑盒說明書操作進(jìn)行DNA抽提后取5 μl DNA在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像觀察并拍照。

1．7 Hoechst 33342染色觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以2×108／L的密度接種于6孔板（孔內(nèi)預(yù)置消毒過的蓋玻片），分5組：正常組、AIA組、環(huán)巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組。每孔2 ml，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度環(huán)巴胺（0.4、2、10 μmol／L）的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX通透，PBS洗滌，滴加入終濃度為10 mg／L的Hoechst 33342避光染色20 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1．8 Annexin V-FITC／PI雙染法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率 按1．7項(xiàng)進(jìn)行細(xì)胞分組和藥物處理，吸取上清液至離心管，貼壁細(xì)胞用PBS洗滌，胰酶消化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入相應(yīng)離心管，1 500 r／min離心10 min，收集細(xì)胞。PBS洗滌后加入400 μl Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液4℃孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用WinMDI軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1．9 RT-PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá) 按1．7項(xiàng)進(jìn)行細(xì)胞分組和藥物處理，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按Fermentas試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列及退火溫度（Tm）如表1所示。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，退火60 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過光密度掃描，凝膠成像拍照并用Labworks軟件測(cè)定條帶灰度值。

表1　引物序列

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示；組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 光學(xué)顯微鏡下傳1代的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，胞質(zhì)豐富，核為圓形或橢圓形，細(xì)胞周圍可見具有折光性的細(xì)胞外基質(zhì)（圖1A）。免疫組化染色結(jié)果顯示大鼠軟骨細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕色，細(xì)胞生長越密集的地方染色越深，說明培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中有Ⅱ型膠原表達(dá)，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（圖1B）。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示大鼠軟骨細(xì)胞胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色，胞核被染成深藍(lán)色，可見有的軟骨細(xì)胞為雙核（圖1C）。

2．2 環(huán)巴胺對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

MTT法檢測(cè)體外給予環(huán)巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）48 h后對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響。AIA組軟骨細(xì)胞的增殖明顯低于正常組（F＝12.09，P＜0.01）。環(huán)巴胺體外給藥能劑量依賴性地提高AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，其中2、10、50 μmol／L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12.09，P＜0.05，P ＜0.01）。見圖2。考慮到0.08 μmol／L作用不顯著，10、50 μmol／L兩個(gè)環(huán)巴胺濃度作用相當(dāng)，故取0.4、2、10 μmol／L 3個(gè)濃度進(jìn)行下一步研究。

2．3 DNA電泳觀察環(huán)巴胺抑制AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可見清晰、典型的凋亡細(xì)胞DNA梯狀條帶，環(huán)巴胺0.4、2、10 μmol／L給藥組的DNA梯狀條帶均有不同程度地減少，提示AIA軟骨細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞凋亡，而環(huán)巴胺處理能夠有效減少軟骨細(xì)胞凋亡。見圖3。

2．4 Hoechst 33342染色觀察環(huán)巴胺抑制AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后，熒光顯微鏡下可見正常組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核多數(shù)呈均勻的藍(lán)色熒光（圖4A），AIA組細(xì)胞存在核碎裂與染色質(zhì)固縮，表現(xiàn)出凋亡形態(tài)學(xué)改變（圖4B），表明與正常軟骨細(xì)胞相比，AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在異常凋亡過程。環(huán)巴胺給藥組呈現(xiàn)較少的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（圖4C～E），提示環(huán)巴胺對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞起抗凋亡作用。

2．5 Annexin V-PI雙染檢測(cè)環(huán)巴胺抑制AIA關(guān)節(jié)

軟骨細(xì)胞凋亡 在雙變量散點(diǎn)圖上，F(xiàn)ITC－／PI＋（Q1象限）表示死細(xì)胞，F(xiàn)ITC＋／PI＋（Q2象限）表示中晚期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC－／PI－（Q3象限）表示活細(xì)胞，F(xiàn)ITC＋／PI－（Q4象限）表示早期凋亡細(xì)胞，Q2和Q4象限的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例代表細(xì)胞凋亡率（%）。定量分析結(jié)果顯示，與正常組相比，AIA組凋亡率明顯增高（F＝7.665，P＜0.01）；環(huán)巴胺（0.4、2、10 μmol／L）能劑量依賴性地減少AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率，其中2、10 μmol／L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝7.665，P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

2．6 環(huán)巴胺對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Hh信號(hào)通路與凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 PCR擴(kuò)增后所獲目的基因、β-actin的產(chǎn)物均與預(yù)期一致，典型的電泳圖片（圖6A、B）。半定量分析結(jié)果表明：與正常組相比，AIA組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Hh信號(hào)通路相關(guān)基因（Shh、Ptch1、Gli1）mRNA表達(dá)顯著升高（F＝16.61、8.30、22.11，P＜0.01），表明AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Hh信號(hào)通路明顯活化，環(huán)巴胺體外給藥能降低AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上述基因的表達(dá)，抑制Hh通路的過度活化；同時(shí)，AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)顯著下降（F＝22.16，P＜0.01），而促凋亡基因Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯升高（F＝3.376、3.147，P＜0.05，P＜0.01），環(huán)巴胺體外給藥能夠提高Bcl-2 mRNA表達(dá)，并降低Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)，這可能與其抗AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的作用密切相關(guān)。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞類型，參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的損傷及重塑過程，維持軟骨組

織乃至關(guān)節(jié)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其功能異常在RA致殘的病理進(jìn)程中起著病變節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵介導(dǎo)作用［10］。RA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在過度凋亡，抑制其過度凋亡對(duì)RA骨損傷和骨侵蝕有保護(hù)意義［11－12］。研究［4－5］證實(shí)Hh信號(hào)通路通過甲狀旁腺素相關(guān)肽負(fù)反饋調(diào)節(jié)和Hh直接作用的雙重模式影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，為此，本研究建立AIA大鼠模型，分離培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，以Hh信號(hào)通路阻斷劑環(huán)巴胺作為實(shí)驗(yàn)藥物，觀察體外干預(yù)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Hh信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。

本研究采用MTT法觀察了環(huán)巴胺體外給藥對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示環(huán)巴胺（0.08、0.4、2、10、50 μmol／L）體外給藥能劑量依賴性地提高AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，提示環(huán)巴胺對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。DNA電泳是檢測(cè)凋亡發(fā)生時(shí)DNA片段或多聚體組成的寡核苷酸片段的標(biāo)準(zhǔn)方法，其典型結(jié)果是“梯狀帶”。AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可見典型的DNA梯狀條帶，環(huán)巴胺（0.4、2、10 μmol／L）體外作用48 h后的梯狀條帶明顯減少，大多僅見離點(diǎn)樣孔不遠(yuǎn)的基因組DNA，以環(huán)巴胺2 μmol／L最明顯。Hoechst 33342為特異性DNA染料，采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?cè)u(píng)判細(xì)胞凋亡情況。本實(shí)驗(yàn)中正常組細(xì)胞呈均質(zhì)藍(lán)色熒光，而AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞皺縮明顯，細(xì)胞核呈不同程度的致密濃染或碎塊狀，染色質(zhì)固縮、聚集，存在細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變；環(huán)巴胺給藥組的均勻藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡細(xì)胞數(shù)相對(duì)減少。采用Annexin-V FITC／PI雙染法進(jìn)一步檢測(cè)了環(huán)巴胺對(duì)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的抗凋亡作用，結(jié)果表明AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率與正常組相比顯著增高，環(huán)巴胺（0.4、2、10 μmol／L）能劑量依賴性地減少AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率。上述結(jié)果均提示AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞凋亡過程，而環(huán)巴胺體外給藥能有效抑制其過度凋亡。

哺乳動(dòng)物的Hh信號(hào)通路包括4個(gè)部分：Hh蛋白、跨膜受體Ptch和Smo、核轉(zhuǎn)錄因子Glis、下游靶基因［13］。RT-PCR結(jié)果表明AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Shh、Ptch1、Gli1 mRNA的水平均較正常組顯著升高，表明Hh信號(hào)通路存在異常激活或傳導(dǎo)異常，環(huán)巴胺體外給藥能明顯降低上述基因的表達(dá)水平，有效抑制該通路過度活化，這可能與環(huán)巴胺促進(jìn)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、抑制其過度凋亡密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是由多種基因參與的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，與細(xì)胞增殖和癌變有關(guān)的癌基因和抑癌基因都參與了對(duì)凋亡的調(diào)控。Bcl-2基因家族中的Bcl-2和Bax基因與細(xì)胞凋亡的關(guān)系倍受關(guān)注，其中Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2能延長細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡［14］。Caspase-3是各條凋亡通路作用的樞紐，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體，抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細(xì)胞凋亡受抑制［15］。有文獻(xiàn)［11］證實(shí)，RA關(guān)節(jié)軟骨組織中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，密切參與RA關(guān)節(jié)軟骨的異常凋亡過程。與其一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下降，而Bax 和Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高，環(huán)巴胺體外給藥能上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，抑制Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其抗凋亡作用。

綜上所述，Hh信號(hào)通路阻斷劑環(huán)巴胺體外能促進(jìn)AIA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖，并抑制其過度凋亡，該抗凋亡作用和調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)密切相關(guān)，提示干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Hh信號(hào)通路對(duì)保護(hù)RA關(guān)節(jié)軟骨具有潛在的治療意義。

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Effects of cyclopamine on the proliferation and apoptosis of chondrocytes in adjuvant-induced arthritis rats and its anti-apoptotic mechanisms

Ding Jing1，Li Rong2，Hu Xiangyang1，et al
（1Dept of Pathology，2College of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To explore the effects of cyclopamine，a hedgehog（Hh）signal pathway inhibitor，on the proliferation and apoptosis of articular chondrocytes in adjuvant-induced arthritis（AIA）rats and its anti-apoptotic mechanisms．Methods Freund’s complete adjuvant was used to induce AIA．Articular chondrocytes were isolated and cultured by trypsin and collagenase digestion method．AIA articular chondrocytes were treated by cyclopamine in vitro．The cell proliferation was detected by MTT assay．The cell apoptosis was evaluated with DNA agarose gel electrophoresis，hoechst staining and flow cytometry analysis．The levels of Shh，Ptch1，Gli1，Bcl-2，Bax and Caspase-3 mRNA were detected by RT-PCR．Results Cyclopamine（0.08，0.4，2，10，50 μmol／L）could increase AIA articular chondrocytes proliferation in a dose-dependent．DNA ladder pattern was formed typically in AIA articular chondrocytes，while cyclopamine（0.4，2，10 μmol／L）treatment could reduce the formation of DNA ladder．AIA articular chondrocytes displayed nuclei fragmentation with condensed chromatin and cyclopamine could promote the number of uniform blue fluorescent cells．Flow cytometry analysis also indicated cyclopamine could visibly reduce the rate of apoptotic cells in AIA articular chondrocytes．Compared with normal group，the levels of Hh pathway-related genes（Shh，Ptch-1 and Gli1）mRNA apparently increased in AIA articular chondrocytes．Antiapoptotic gene Bcl-2 mRNA level significantly decreased，while pro-apoptotic genes Bax and Caspase-3 mRNA levels were significantly increased．Cyclopamine treatment could inhibit the excessive activation of Hh pathway，upregulate Bcl-2 mRNA expression，and reduce Bax and Caspase-3 mRNA expressions．Conclusion Cyclopamine could promote the proliferation and inhibit excessive apoptosis of AIA articular chondrocytes，which might be related to regulation of Bcl-2，Bax，and Caspase-3 expressions．Our results suggest that intervention of Hh signal in articular chondrocytes has potential therapeutic significance for articular cartilage protection in rheumatoid arthritis．

Key wordshedgehog signal pathway；cyclopamine；adjuvant-induced arthritis；articular chondrocytes；proliferation；apoptosis

作者簡介：丁 婧，女，碩士研究生；胡向陽，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yfhxy2013＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81102273）；教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)：20113420120005）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0446－06

中圖分類號(hào)R 593．22；R 967