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湖羊和徐淮山羊CaSR基因組織表達(dá)水平的初步分析

楚素芳，金晶，張吉順，張春雷，王艷紅，房興堂*

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

[摘要]為分析鈣敏感受體(CaSR)基因?qū)蚝托旎瓷窖蛳盏淖饔?，?個月齡的湖羊和徐淮山羊為試驗材料，利用熒光定量PCR SYBR Green Ⅱ 熒光染料法，對湖羊和徐淮山羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸10個組織中CaSR基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果表明：在湖羊的樣品組織中，CaSR基因在十二指腸中表達(dá)量最高，其次是回腸，兩者的表達(dá)量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；CaSR基因在瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、空腸、盲腸、結(jié)腸、直腸中的表達(dá)量顯著低于在十二指腸及回腸中的表達(dá)量(P<0.05)。在徐淮山羊的組織樣中，CaSR基因在回腸中的表達(dá)量最高，其次是十二指腸，且二者差異顯著(P<0.05)；另外，該基因在回腸和十二指腸的表達(dá)量顯著高于在瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、空腸、直腸中的表達(dá)量(P<0.05)，盲腸和結(jié)腸中該基因的表達(dá)量最低。通過試驗說明CaSR在不同組織里的表達(dá)具有特異性，在不同的物種間主要表達(dá)組織也不同，表明湖羊和徐淮山羊具有不同的消化吸收方式。

[關(guān)鍵詞]湖羊；徐淮山羊；CaSR基因；mRNA表達(dá)量；熒光定量PCR

20世紀(jì)末，世界養(yǎng)羊業(yè)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，由毛用轉(zhuǎn)向肉用或肉毛兼用，而在肉用方面也由生產(chǎn)大羊肉轉(zhuǎn)向生產(chǎn)小羊肉。隨著人們生活水平的提高，對羊肉需求量逐年增加，對羊肉的口感及質(zhì)量也提出更高的要求，提高肉羊的生產(chǎn)性能和改善肉質(zhì)成為肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。鈣敏感受體(Calcium-sensingReceptor，CaSR)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，表達(dá)于哺乳動物的大多數(shù)組織中，如甲狀旁腺、骨骼、乳腺、腎臟、胃、腸道等[1-5]，對維持機(jī)體Ca2+穩(wěn)態(tài)起重要作用[6]，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和凋亡[7-8]。Tfelt-Hanse等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞中有CaSR功能性表達(dá)。Molostvov等[10]證明，CaSR在慢性腎臟疾病患者發(fā)生的血管鈣化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最新研究表明，激活CaSR的氨基酸能顯著刺激胃酸的產(chǎn)生[11]。另有研究證實，激活CaSR的氨基酸能調(diào)控激素的分泌，而這些激素對鈣代謝的調(diào)控、生長發(fā)育、腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收等方面都發(fā)揮著重要作用[12]。景坤玉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CaSR基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與食管鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。這些結(jié)果都表明，CaSR基因在動物胃腸道中表達(dá)，可以促進(jìn)消化，使得水、常量營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素得以吸收。為進(jìn)一步探討CaSR基因在家畜胃腸道中表達(dá)情況及其功能，本研究以湖羊和徐淮山羊的胃腸組織為試驗材料，分析CaSR基因在湖羊和徐淮山羊消化道不同部位mRNA的表達(dá)模式與規(guī)律，探討CaSR基因?qū)蚝托旎瓷窖虻哪c胃吸收消化功能的影響，為研究CaSR基因功能和營養(yǎng)的吸收調(diào)控機(jī)制、動物的飼料配比提供有效的理論支持。

1材料與方法

1.1　試驗材料的采集

采集6月齡湖羊和徐淮山羊(各3只)的整個消化系統(tǒng)，包括瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸10個組織，用預(yù)冷的無菌生理鹽水洗去胃腸道殘留物和血液，錫箔紙包好后，立即放入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至 -80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　主要試劑和儀器

Trizol總RNA提取試劑盒購于北京天根生物科技有限公司，PrimeScript○RRT reagent KIT (perfect Real Time)試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；微量紫外分光光度計(NANODROP 2000C，基因有限公司)，實時熒光定量PCR儀(step one，美國AB)，凝膠成像儀(BIO-RAD CelDoc EQ，美國)，PCR儀(MJ Research PTC-200，美國)。

1.3　引物設(shè)計與合成

參照GenBank中已公布的羊CaSR(GenBank登記號： XM-004002971.1)和β-actin基因(GenBank 登記號：NM-001009784.1)的mRNA序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，引物由上海生物工程公司合成，引物信息見表1。

表1　CaSR、β-actin 基因PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.4　RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取組織塊0.5 mg在液氮預(yù)冷的研缽中研磨，按照E.Z.N.ATM Total RNA KitⅠ試劑盒操作說明提取組織總RNA，總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，超微量紫外可見分光光度計測定總RNA濃度和純度。按照PrimeScript○RRT reagent KIT操作說明對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.1總RNA中基因組DNA的去除1 μg總RNA，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O補(bǔ)加至10 μL，冰上操作并混勻，隨后42 ℃水浴2 min。

1.4.2cDNA的合成在上述反應(yīng)液中加入1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，1 μL RT Prime Mix，4 μL 5×Prime Script Buffer 2(for real time)，4 μL RNase Free dH2O，總體積為20 μL?；旌虾?7 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃滅活5 s，4 ℃溫育10 s。RT產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5　引物特異性鑒定與目的基因克隆

分別以湖羊和徐淮山羊十二指腸組織cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，觀察條帶是否單一來初步判斷引物特異性。擴(kuò)增體系為20 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，dH2O 7.0 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA1 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用SanPrep柱式膠回收試劑盒回收純化目的片段并進(jìn)行目的片段的克隆。PCR反應(yīng)體系：1 μL模板，7.6 μL 2×Reaction Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性6 min,94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性菌落用于質(zhì)粒提取，送上海生工生物有限公司測序。

1.6　熒光定量PCR

以湖羊和徐淮山羊胃腸道各10個組織樣本cDNA為模板，用CaSR基因特異性引物進(jìn)行實時熒光定量PCR。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線是否單一來檢測引物的特異性。熒光定量PCR反應(yīng)總體系為20 μL：0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cDNA，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，上下游引物各0.8 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火溫度1 min，40個循環(huán)，然后對熔解曲線進(jìn)行分析。每個樣品進(jìn)行3次平行試驗，計算平均值。每批次試驗中設(shè)陰性對照，并記錄各樣品的Ct值。

1.7　統(tǒng)計分析

組織樣品設(shè)置相同的閾值線，β-actin作內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用JMP 4.0計算重復(fù)樣品間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)，分析基因在各組織間的相對表達(dá)差異量。用SPSS 11.5軟件對湖羊和徐淮山羊不同組織間CaSR基因的差異表達(dá)進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1　湖羊和徐淮山羊組織RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示清晰的28S和18S條帶。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260/OD280=1.8~2.0，表明RNA具有較好的完整性和較高的純度，可以進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2　CaSR和β-actin基因引物特異性檢測

引物特異性檢測采用普通PCR判定。結(jié)果顯示基因擴(kuò)增片段大小和預(yù)測的一致，如圖2。CaSR基因擴(kuò)增片段測序結(jié)果與羊CaSR基因(GenBank登記號： XM-004002971.1)同源性為100%，β-actin基因(GenBank登記號：NM-001009784.1)同源性為100%，表明擴(kuò)增片段無誤。

圖1　總RNA瓊脂糖電泳的檢測

圖2　CaSR和β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3　CaSR基因在湖羊和徐淮山羊消化道組織中的表達(dá)譜

湖羊和徐淮山羊CaSR基因在10種組織中的相對表達(dá)量見圖3。在湖羊消化系統(tǒng)中，CaSR基因在十二指腸中表達(dá)量最高，為29.71。其次是回腸，表達(dá)量為26.31。兩者的表達(dá)量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，二者與在瘤胃、瓣胃、結(jié)腸中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；而CaSR基因在瘤胃、瓣胃、結(jié)腸的表達(dá)量間沒有顯著差異(P>0.05)，與網(wǎng)胃、皺胃、空腸、直腸中的表達(dá)量有差異，但不顯著(P>0.05)；CaSR基因在盲腸中的表達(dá)量最低，僅為0.83。在徐淮山羊的消化系統(tǒng)中，CaSR基因在回腸中的表達(dá)量最高，為32.64。其次是十二指腸，表達(dá)量為24.42。兩者中的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。在瘤胃、瓣胃中，CaSR基因的表達(dá)量顯著低于在十二指腸中的表達(dá)量(P<0.05)，而在網(wǎng)胃、皺胃、空腸、直腸4個組織中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，在盲腸和結(jié)腸中CaSR基因的表達(dá)量最低，分別為0.22和0.19。

3討論

動物的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的生理過程，受到遺傳、環(huán)境以及營養(yǎng)水平的影響。動物攝取的蛋白質(zhì)分解成小肽，主要依靠位于腸道刷狀緣膜上的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)器吸收。CaSR通過接受細(xì)胞信使-Ca2+濃度的高低來調(diào)控生物體內(nèi)離子的平衡、激素的分泌[14]，以調(diào)節(jié)動物的生理活動。

圖3　湖羊和徐淮山羊消化道各段CaSR基因相對表達(dá)量

注：大寫字母表示CaSR基因在湖羊不同組織間的差異；小寫字母表示CaSR基因在徐淮山羊不同組織間的差異(P<0.05)。

Note: The uppercase letters indicate the differences ofCaSRgene in different tissues of sheep; the lowercase indicate the differences ofCaSRgene in different tissues of goat (P<0.05).

從本研究試驗結(jié)果看，CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的各組織中表達(dá)存在差異。CaSR基因在湖羊及徐淮山羊的瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃中都有表達(dá)，這與Conigrave[15]和Geibel[16]的研究結(jié)果一致，表明CaSR在胃上皮細(xì)胞表達(dá)，使大量的營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素和水得以吸收。瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃和十二指腸吸收的小肽進(jìn)入非腸膜系統(tǒng)，而由空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸吸收的小肽進(jìn)入腸膜系統(tǒng)，非腸膜系統(tǒng)是反芻動物小肽吸收的主要途徑，其吸收的小肽數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。由此推測存在于瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃和十二指腸中的營養(yǎng)識別信號分子量應(yīng)高于空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸，這與本試驗結(jié)果顯現(xiàn)的趨勢相吻合。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的十二指腸及回腸表達(dá)量較高，這與Chakrabarty[17]的結(jié)果相似，說明絨毛、小腸和結(jié)腸的腺細(xì)胞及腸肌層廣泛分布CaSR基因，進(jìn)一步證明CaSR可促進(jìn)胃泌激素、膽囊收縮素等腸道激素的分泌，與蛋白質(zhì)的消化、多肽和氨基酸的吸收和機(jī)體新陳代謝有關(guān)[18-19]，并且對腸的蠕動及結(jié)腸細(xì)胞的增生、分化有一定的生物學(xué)作用[20]。

氨基酸的識別由不同的氨基酸受體特異性決定，胞外的CaSR能夠?qū)Ψ枷阕灏被?、脂肪族氨基酸和極性氨基酸做出反應(yīng)[21]。本次試驗結(jié)果表明CaSR基因在十二指腸中的表達(dá)量湖羊高，徐淮山羊表達(dá)量低，在回腸中徐淮山羊高度表達(dá)，湖羊相對較低，推測湖羊和徐淮山羊?qū)aSR識別的氨基酸吸收的主要場地不同，這可能是由湖羊和徐淮山羊的生長環(huán)境、飼料結(jié)構(gòu)不同所致。徐淮山羊適于放牧，對氣味不正或已踐踏過的飼草不采食，喜歡采食灌木嫩枝條，采食的飼草種類較湖羊更豐富，因此產(chǎn)生的能被回腸吸收的特殊的寡肽量較湖羊中多[22]，致使與之結(jié)合的氨基酸受體也多，CaSR基因的表達(dá)量隨之增加。湖羊多處于圈養(yǎng)，采食人工配制飼料，其中多含有豐富的蛋白質(zhì)，易于小腸的消化和吸收。尤其是在十二指腸中，它是大部分氨基酸吸收的主要場所，需要更多的受體幫助吸收，因此在湖羊的十二指腸中CaSR基因的表達(dá)量較徐淮山羊高。

4結(jié)論

CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的十二指腸及回腸中高表達(dá)，瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃中普遍表達(dá)；CaSR基因在湖羊和徐淮山羊的組織間表達(dá)存在特異性和差異性。

CaSR基因在胃腸系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收消化起到調(diào)控作用。

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Tissue Expression Analysis ofCaSRGene in Hu Sheep and Xuhuai Goat

CHU Su-fang, JIN Jing, ZHANG Ji-shun, ZHANG Chun-lei, WANG Yan-hong, FANG Xing-tang*

(CollegeofLifeScience,JiangsuNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221116,China)

Abstract:In order to study the role of Calcium-sensing Receptor (CaSR) in digestion and absorption in digestive tract of sheep and goat, the relative expressions of CaSR gene were analyzed by real-time quantitative PCR with SYBR GreenⅡin rumen, reticulum, omasum, abomasum, duodenal, jejunum, ileum, cecum, colonic, rectum, testes of 6-month-old male Hu sheep and Xuhuai goat. The results showed that CaSR gene expression was the highest in the duodenal of Hu sheep. The second is the ileum. The expression difference between duodenal and ileum reached a significant level (P<0.05). And in rumen, reticulum, omasum, abomasum, jejunum, caecum, colonic and rectum, the expression of CaSR gene is significantly lower than that in duodenal and ileum (P<0.05). In the goat tissue samples, CaSR gene expression was the highest in the ileum, significantly higher in the duodenal (P<0.05). Both were markedly higher than the levels of gene expression in rumen, reticulum, omasum, abomasum, jejunum and rectum (P<0.05). The expression of CaSR gene detected in cecum and colonic was extremely low. The results suggested that the expression of CaSR gene in different tissues was of specificity, and it expressed differently in the main expression of tissue between Hu sheep and goat, which indicated that Hu sheep and Xuhuai goat had different digestive absorption method.

Key words:Hu sheep; Xuhuai goat; CaSR gene; mRNA expression; real-time quantitative PCR

[中圖分類號]S811.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1005-5228(2015)11-0017-05

*[通訊作者]房興堂(1963-)，男，江蘇沛縣人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物遺傳資源及利用。E-mail：xtfang@163.com

[作者簡介]楚素芳(1989-)，女，河南睢縣人，碩士研究生，研究方向：動物細(xì)胞與分子生物學(xué)。E-mail：1273174596@qq.com

[基金項目]江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)工程項目(JHB2012-32)；徐州市科技計劃項目(XF12C052，KC14N0061)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

*[收稿日期]2015-04-13修回日期：2015-05-28