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Lin28調(diào)控let-7 microRNA合成機(jī)制的研究進(jìn)展

張亞莉1，曹貴玲1*，儲(chǔ)明星2，王桂英1

(1 聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城252059；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193)

[摘要]Lin28是在胚胎干細(xì)胞中廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，參與分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生、葡萄糖代謝等多個(gè)生命過(guò)程。Lin28執(zhí)行這些功能主要是通過(guò)抑制let-7 miRNA的生物合成，并且主要依賴Lin28氨基端冷休克結(jié)構(gòu)域和羧基端鋅指結(jié)構(gòu)域。最近一些結(jié)構(gòu)學(xué)研究揭示了Lin28調(diào)控let-7合成機(jī)制，Lin28結(jié)合在pri-let-7和pre-let-7的末端loop上，從而阻斷Drosha和Dicer的加工，這些互作的特異性主要由鋅指結(jié)構(gòu)域和保守的GGAG模體介導(dǎo)。本文就Lin28如何通過(guò)其結(jié)構(gòu)域與let-7miRNA前體特異性結(jié)合，特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)等進(jìn)行了綜述，以期為相關(guān)研究提供借鑒。

[關(guān)鍵詞]Lin28；let-7 microRNA；調(diào)控機(jī)制；結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Lin28(Cell lineage abnormal 28)是高等真核細(xì)胞中保守的RNA結(jié)合蛋白，調(diào)控分化、發(fā)育、多潛能性、腫瘤發(fā)生及葡萄糖代謝等幾個(gè)重要的細(xì)胞功能。Lin28最初是在線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)異時(shí)基因，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間發(fā)生紊亂[1-2]。Lin28含有兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是氨基端的冷休克結(jié)構(gòu)域(Cold shock domain, CSD)，一個(gè)是羧基端的兩個(gè)串聯(lián)排列的CCHC (Cys-Cys-His-Cys)鋅指結(jié)合motif (CCHC×2)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在動(dòng)物中高度保守。哺乳動(dòng)物含有兩個(gè)Lin28同源基因，即Lin28a和Lin28b，在分子水平二者是let-7 microRNA合成的負(fù)調(diào)控因子。

Let-7 miRNA 是目前研究最為廣泛的microRNA家族之一。哺乳動(dòng)物let-7 miRNA家族中含有12個(gè)成員(let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i和Mir-98)，由8個(gè)位點(diǎn)表達(dá)[3-4]。let-7 miRNA轉(zhuǎn)錄后加工和其他miRNA一樣，首先核定位RNA酶III Drosha將長(zhǎng)的miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)切割，產(chǎn)生一個(gè)60~80 nt的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、3'-端具有2 nt突出的產(chǎn)物，被稱為pre-miRNA；pre-miRNA被exportin-5:RanGTP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，被Dicer切割產(chǎn)生成熟的miRNA。

1Lin28阻斷l(xiāng)et-7的成熟過(guò)程

Lin28和let-7 miRNA表達(dá)模式最初在研究線蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)[2,4-6]。在幼蟲(chóng)發(fā)育早期，Lin28和pri-let-7都表達(dá)，但pre-let-7和成熟的let-7未被檢測(cè)到，表明其成熟過(guò)程有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[7]。這種調(diào)控關(guān)系在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也存在，Lin28a/b主要在未分化細(xì)胞中表達(dá)，而成熟的let-7只是在已分化或組織發(fā)育中能檢測(cè)到[8-10]。另外，pri-let-7在整個(gè)分化或發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量不變，說(shuō)明在干細(xì)胞或祖細(xì)胞中Lin28a/b 對(duì) let-7有負(fù)反饋調(diào)控[11-13]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Lin28阻斷l(xiāng)et-7的成熟過(guò)程主要有兩種機(jī)制：一種是Lin28a/b與let-7前體結(jié)合，阻礙Drosha和Dicer對(duì)let-7前體切割位點(diǎn)的識(shí)別。Lin28a/b能特異性與pri-let-7、pre-let-7結(jié)合并抑制pri-let-7[9,14-15]、pre-let-7[8]的加工。RNA和染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)表明，Lin28和pri-let-7之間有特異的互作，從而抑制Drosha對(duì)pri-let-7的加工。另外，Lin28b主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，并在核內(nèi)結(jié)合pri-let-7使其避免與Drosha結(jié)合，阻斷Drosha的加工[16]。在人胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cell, ESC)和神經(jīng)元干/祖細(xì)胞中，Lin28與內(nèi)源pri-let-7也有互作[7]。一個(gè)高水平表達(dá)的RNA-結(jié)合蛋白Musashi 1(Msi 1)可能也參與了上述過(guò)程，Msi 1選擇性招募Lin28到細(xì)胞核內(nèi)，起到協(xié)同作用[17]。Lin28通過(guò)與Dicer切割位點(diǎn)附近的雙鏈stem和pre-element (preE terminal loop或 hairpin)結(jié)合，阻斷Dicer對(duì)let-7前體的加工[14]。 此外有研究表明，Lin28a/b能誘導(dǎo)pre-let-7 preE的結(jié)構(gòu)變化，使包括Dicer切割位點(diǎn)在內(nèi)的雙鏈stem打開(kāi)[18-20]，使Dicer不再識(shí)別原有切割位點(diǎn)從而阻斷Dicer的切割。

Heo等[21-22]提出了另外一種抑制模式，這種加工模式會(huì)使pre-let-7降解。Lin28a/b誘導(dǎo)pre-let-7的3'-突出的寡核苷酸發(fā)生尿苷化(oligo-uridylation)，oligo-尿苷化的pre-let-7可以抵抗Dicer的切割。正常情況下，Dicer通過(guò)它的PAZ 結(jié)構(gòu)域識(shí)別miRNA前體上2 nt 3'端突出。尿苷化后，Dicer就不能識(shí)別延長(zhǎng)了的3'-突出，從而不能對(duì)pre-let-7進(jìn)行加工。oligo-尿苷化的RNA會(huì)招募3'-5'核酸外切酶，之后被降解[21-23]。Chang等[24]在小鼠ESC中發(fā)現(xiàn)，3'-5'核酸外切酶Dis312能催化pre-let-7的降解，Dis312 敲減會(huì)使小鼠ESC中尿苷化的pre-let-7聚集。尿苷化的pre-let-7比未發(fā)生尿苷化的 pre-let-7更容易降解[21]。Pre-let-7的oligo-尿苷化由非經(jīng)典的poly(A)聚合酶--末端轉(zhuǎn)移酶4(Terminal uridyly oligo transferase 4，TUT4，又稱Zcchc11)和TUT7(又稱Zcchc6)催化，這些酶依賴Lin28[22,25-27]。但是，TUT4和 TUT7在沒(méi)有Lin28時(shí)會(huì)催化具有1 nt 3'-突出的pre-miRNA的單核苷酸發(fā)生尿苷化(mono-uridylation)，此單核苷酸尿苷化會(huì)促進(jìn)Dicer的加工[28]。在有Lin28存在時(shí)，pre-let-7和其他preE中含有GGAG模體的miRNA更傾向發(fā)生oligo-尿苷化，GGAG模體對(duì)于RNA結(jié)合和oligo-尿苷化是必需的[22]。線蟲(chóng)中也有類似的加工機(jī)制，線蟲(chóng)使用的尿苷化酶是poly(U)聚合酶2(Poly(U) polymerase, PUP2)。PUP2以依賴Lin28的方式使pre-let-7發(fā)生oligo-尿苷化，從而抑制let-7的成熟[29]。

因此，Lin28通過(guò)兩種機(jī)制三種途徑調(diào)控let-7 miRNA的成熟過(guò)程(見(jiàn)圖1)。第一，在細(xì)胞核內(nèi)Lin28抑制Drosha對(duì)pri-let-7的加工；第二，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Lin28抑制Dicer對(duì)pre-let-7的加工；第三，Lin28招募TUT4(TUT7)結(jié)合到pre-let-7，引起pre-let-7的3'-端發(fā)生尿苷化，尿苷化的pre-let-7之后被降解。而成熟的let-7結(jié)合在lin28的3'-UTR區(qū)域從而對(duì)lin28的表達(dá)起抑制作用。

圖1　Lin28調(diào)控let-7 miRNA的加工機(jī)制

2Lin28/RNA結(jié)合特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Lin28的CSD和CCHC結(jié)構(gòu)域?qū)re-let-7的結(jié)合都是必須的，刪除任何一個(gè)都會(huì)影響與pre-let-7的高度親和性，但是刪除氨基末端和羧基末端(約30個(gè)氨基酸殘基)不會(huì)影響與pre-let-7的結(jié)合[18]。在Lin28和pre-let-7 preE形成的晶體結(jié)構(gòu)中，preE的loop環(huán)繞Lin28的CSD，形成一個(gè)領(lǐng)帶，stem交叉形成領(lǐng)結(jié)，并且CCHC鋅指與3'-stem的GGAG模體相結(jié)合[18]。Desjardins等[30]提出了Lin28與let-7 miRNA前體形成復(fù)合體的模型，表明在二者結(jié)合過(guò)程中CSD和CCHC鋅指是相互相互配合、缺一不可的。

2.1　Lin28鋅指結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別GGAG模體

為了確定Lin28與let-7前體之間特定互作關(guān)系，科學(xué)家研究了Lin28和let-7前體互作的特異性。用pre-let-7不同序列進(jìn)行凝膠阻滯分析，結(jié)果表明單獨(dú)的pre-let-7末端loop(也稱為pre-element或preE)也能滿足與Lin28a的結(jié)合[14]。對(duì)let-7前體的stem-loop比對(duì)發(fā)現(xiàn)let-7前體中有一個(gè)脊椎動(dòng)物高度保守的GGAG模體對(duì)Lin28的結(jié)合非常重要，這個(gè)motif發(fā)生突變(GGAG--AAAG，GGAG--GUAU)會(huì)使Lin28a介導(dǎo)的pri-let-7或pre-let-7的加工阻斷解除，且TUT4介導(dǎo)pre-let-7 oligo-尿苷化受損[15,22]。將GGAG模體引入不相關(guān)的miRNA(如pre-mir-16-1)pre E中，Lin28a會(huì)與這個(gè)嵌合pre-miRNA結(jié)合，并且TUT4介導(dǎo)的尿苷化也會(huì)發(fā)生[22]。

Lin28的ZKD發(fā)生突變會(huì)破壞其與pre-let-7的特異性結(jié)合，也會(huì)破壞單獨(dú)ZKD與含GGAG模體 的RNA結(jié)合[18,20,22,31-32]。小鼠Lin28a與pre-let-7來(lái)源的含GGAG 的寡核苷酸之間的共晶體結(jié)構(gòu)和人Lin28a ZKD結(jié)合AGGAGAU的核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)溶液結(jié)構(gòu)顯示Lin28的ZKD與GGAG模體之間發(fā)生了特異性結(jié)合[18,32]。兩個(gè)CCHC鋅指直接與Let-7 GGAG模體結(jié)合并在RNA骨架中形成一個(gè)特征性的扭結(jié)。在這個(gè)扭結(jié)構(gòu)象中，Lin28的Y140非常關(guān)鍵，它位于AG之間，形成夾心狀，并且與H162互作，形成扭結(jié)構(gòu)象。堿基A沒(méi)有與Lin28形成很多極性互作，但它壓緊了第一個(gè)G，并與之形成氫鍵，輔助形成扭結(jié)構(gòu)象。這種特異性結(jié)合主要通過(guò)氫鍵完成，CCHC鋅指結(jié)合GGAG的G1和G4，氫鍵由鋅指剛性部分的氨基酸殘基的羰基和氨酰基骨架介導(dǎo)。除了特異性互作，G1和G4插在由第一個(gè)鋅指中的酪氨酸和組氨酸與第二個(gè)鋅指中的組氨酸和蛋氨酸形成的一個(gè)疏水口袋中。在小鼠的Lin28a:GGAG復(fù)合體中，G2也通過(guò)A3的羰基骨架和N1氨基形成氫鍵從而產(chǎn)生序列特異性結(jié)合。A3也參與了RNA骨架中扭結(jié)的形成，與G1相互作用[18]。NMR溶液結(jié)構(gòu)顯示第二個(gè)CCHC鋅指在與RNA結(jié)合時(shí)發(fā)生了較大的結(jié)構(gòu)變化，中心的鋅離子移動(dòng)了大約25 ?，是由富含脯氨酸的linker區(qū)的Pro158導(dǎo)致的這樣一個(gè)大的構(gòu)象變化[32]。在人Lin28a:AGGAGAG結(jié)構(gòu)的RNA骨架中未發(fā)現(xiàn)如此強(qiáng)的扭結(jié)彎曲，RNA與蛋白結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致相鄰的雙鏈pre-let-7 stem保持開(kāi)鏈狀態(tài)，從而掩蓋了Dicer的切割位點(diǎn)[18,20,33]。有趣的是，TUT4和TUT7 也含有CCHC 鋅指[27]，這些鋅指之間的距離比Lin28鋅指之間的距離大些，可能表明他們發(fā)揮作用不依賴于對(duì)方。

2.2　Lin28 CSD決定結(jié)合的親和力，重塑RNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)

盡管Lin28鋅指結(jié)構(gòu)域可以特異結(jié)合GGAG模體，但單獨(dú)的Lin28 ZKD自身不能與let-7結(jié)合來(lái)阻斷其加工，需要CSD的參與[18,20]。CSD區(qū)和preE的loop區(qū)結(jié)合在一起，loop區(qū)環(huán)繞在CSD 結(jié)構(gòu)域，形成一個(gè)領(lǐng)帶狀，stem區(qū)交叉形成領(lǐng)結(jié)，當(dāng)loop環(huán)繞在Lin28 CSD上時(shí)，堿基伸出與芳香側(cè)鏈形成一些Ψ-堆積作用，疏水作用力、氫鍵和立體排阻決定了核苷酸的優(yōu)先次序并增強(qiáng)了特異性[18]。

系統(tǒng)結(jié)合分析表明，爪蟾Lin28b CSD具有廣泛的序列特異性，與5'-末端至少有一個(gè)尿苷的富含嘧啶的RNA八核苷酸具有最高的親和力[20]。這一現(xiàn)象之后被genome-wild PAR-CLIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Lin28a/b結(jié)合位點(diǎn)一般富含U，側(cè)翼有一個(gè)或多個(gè)尿苷，并且這些位點(diǎn)都是位于相應(yīng)的ZKD結(jié)合位點(diǎn)的上游[34-35]。Lin28 CSD與preE-Let-7的共晶體結(jié)構(gòu)提供了有價(jià)值的信息，Lin28 CSD通過(guò)一個(gè)保守的核酸結(jié)合平臺(tái)結(jié)合單鏈核酸。與ZKD不同的是，這個(gè)結(jié)合平臺(tái)在結(jié)合核酸之前已經(jīng)形成，核酸結(jié)合后只發(fā)生一些細(xì)微變化[36]。Lin28 CSD結(jié)合8個(gè)核苷酸，這些核苷酸以確定的方向沿著一個(gè)彎曲的單鏈排列。在小鼠Lin28a:preE-let-7結(jié)構(gòu)中，另外第九個(gè)核苷酸可見(jiàn)，并且它與第一個(gè)堿基形成氫鍵，把preE stem-loop 閉合，序列特異性結(jié)合主要發(fā)生在第6個(gè)核苷酸上。

除了影響結(jié)合親和力和特異性，Lin28 CSD還影響和重塑靶RNA內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)。與Lin28a結(jié)合后，preE的某些區(qū)域和pre-let-7的一部分雙鏈stem變得更易被單鏈特異性核酸酶切割，可能是Lin28能夠打開(kāi)pre-let-7 的雙鏈stem，然后封閉Dicer切割位點(diǎn)[19]。Nam等[18]證明，Lin28a CSD能夠使雙鏈stem-loop發(fā)生部分解鏈，從而產(chǎn)生一個(gè)最合適的結(jié)合界面。對(duì)爪蟾Lin28b的研究發(fā)現(xiàn)Lin28 CSD結(jié)合pre-let-7， 誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)變化[20]，保守的組氨酸(爪蟾Lin28b結(jié)合位點(diǎn)4中的組氨酸618)和苯丙氨酸殘基(苯丙氨酸77-結(jié)合亞位點(diǎn)1、2)對(duì)于重塑反應(yīng)起關(guān)鍵作用。CSD誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)重塑可能對(duì)Lin28 ZKD識(shí)別GGAG模體很重要，有利于ZKD的結(jié)合。此外，ZKD可能引起靶RNA結(jié)構(gòu)改變從而促進(jìn)下游過(guò)程如pre-let-7的oligo-尿苷化；CSD的廣泛特異性能使Lin28識(shí)別let-7家族各成員前體。

Lin28的分子伴侶樣作用影響下游RBPs與RNPs的結(jié)合或解離，從而影響他們的加工。 研究表明Dis312核糖核酸外切酶降解oligo-尿苷化的pre-let-7。Dis312是由一個(gè)核糖核酸酶II結(jié)構(gòu)域、2個(gè)CSD和一個(gè)CSD樣S1結(jié)構(gòu)域組成，CSD和S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒is312結(jié)合并降解oligo-尿苷化的pre-let-7都非常重要，假如Lin28 CSD具有U-rich 結(jié)合位點(diǎn)的優(yōu)先性，那么CSD可能識(shí)別oligo(U)尾巴，此外，這可能通過(guò)打開(kāi)miRNA的雙鏈stem推動(dòng)核糖核酸外切酶對(duì)oligo(U)-pre-let-7的降解[24]。

2.3　Linker區(qū)決定Lin28與let-7各成員前體結(jié)合的靈活性

Lin28CSD和CCHC鋅指之間的Linker區(qū)長(zhǎng)度約15個(gè)氨基酸，帶正電。具有靈活性，可以適應(yīng)與具有不同的preE序列和長(zhǎng)度的let-7家族成員相結(jié)合。Linker區(qū)對(duì)Lin28與let-7前體結(jié)合的特異性或親和性影響較少，刪除9個(gè)氨基酸殘基不影響與pre-let-7的結(jié)合[18]。

3問(wèn)題與展望

Lin28調(diào)控let-7miRNA的成熟過(guò)程，而同時(shí)又是let-7的靶基因，二者相互調(diào)控，在正常組織中處于平衡狀態(tài)，一旦平衡打破，就會(huì)引起異常，如腫瘤發(fā)生。Let-7在許多惡性腫瘤中表達(dá)下降，被認(rèn)為是腫瘤抑制因子，而Lin28在這腫瘤中高水平表達(dá)，Lin28可能是通過(guò)作用于let-7而促進(jìn)轉(zhuǎn)化。目前發(fā)現(xiàn)的與Lin28有關(guān)惡性腫瘤有肝癌[37]、乳腺癌[38]、結(jié)腸癌[39]、卵巢癌[40]、肺癌[41]、惡性生殖細(xì)胞腫瘤[42]等。這些腫瘤中，Lin28的相關(guān)活性都與let-7的表達(dá)抑制及l(fā)et-7靶基因緊密相關(guān)。

目前結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)方面研究已經(jīng)揭示了Lin28如何識(shí)別靶RNA從而完成與miRNA調(diào)控相關(guān)的多個(gè)功能。在let-7的合成中，Lin28 ZKD特異性的識(shí)別preE-Let-7的GGAG模體并且誘導(dǎo)RNA骨架發(fā)生彎曲扭結(jié)，使臨近的Dicer 切割位點(diǎn)保持打開(kāi)，不再被Dicer識(shí)別，從而不能再繼續(xù)加工。CSD對(duì)序列沒(méi)有明顯的特異性，只是對(duì)側(cè)翼有一個(gè)鳥(niǎo)苷酸的富含嘧啶序列表現(xiàn)優(yōu)先結(jié)合。

盡管目前的研究揭示了Lin28/let-7調(diào)控的分子機(jī)制，但還有一些問(wèn)題尚未解決，如Lin28在細(xì)胞核中抑制pri-let-7的機(jī)制是什么，Lin28如何促進(jìn)TUT4/TUT7介導(dǎo)的pre-let-7的oligo尿苷化，這是否與TUT4、TUT7中的CCHC鋅指有關(guān)等，理解這些機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)Lin28的功能，找到一些能夠促進(jìn)組織重編程的途徑或者找到一些治療代謝病或癌癥的新的治療方法。

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Research Progress in Molecular Mechanism of Lin28 Mediated let-7 miRNA Regulation

ZHANG Ya-li1, CAO Gui-ling1*, CHU Ming-xing2, WANG Gui-ying

(1.CollageofAgriculture,LiaochengUniversity,Liaocheng,Shandong252059,China;

2.KeyLaboratoryofFarmAnimalGeneticResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture,InstituteofAnimalScience,

ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Abstract:Lin28 is an essential RNA-binding protein that is ubiquitously expressed in embryonic stem cells. Its physiological function has been linked to the regulation of differentiation, development, oncogenesis, and glucose metabolism. Lin28 mediates these functions by inhibiting let-7 miRNA biogenesis and this activity depends on Lin28's amino terminal carboxyl terminal cold shock domain (CSD) and zink knuckle domain (ZKD). Recently, biochemical and structural studies revealed the mechanisms of how Lin28 control let-7 biogenesis. Lin28 binds to the terminal loop of pri- and pre-let-7 miRNA and represses their processing by Drosha and Dicer. The specificity of this interaction is mainly mediated by the ZKD with a conserved GGAG. In this paper, we reviewed the specific interaction and structural basis between Lin28 and precursors of let-7.

Keywords:Lin28; let-7 miRNA; regulation mechanism; structural basis

[中圖分類號(hào)]S811.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-5228(2015)11-0006-06

*[通訊作者]曹貴玲(1982-)，女，山東東明縣人，博士，講師，主要從事羊遺傳育種與生產(chǎn)研究。E-mail：cgLLing@126.com

[作者簡(jiǎn)介]張亞莉(1988-)，女，山東聊城人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物學(xué)。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(31201778)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS13)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2012-2015)

*[收稿日期]2015-03-18修回日期：2015-05-29