郭連英，齊 崢，王化麗，劉 剛

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連116044;2.遼寧師范大學(xué)附屬中學(xué)，遼寧 大連116023;3.大連市婦產(chǎn)醫(yī)院 婦科，遼寧 大連116033;4.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連116027)

卵巢癌是病死率最高的婦科生殖道惡性腫瘤。由于缺乏有效的早期診斷技術(shù)，75%以上卵巢癌患者確診時(shí)為晚期，5年生存率不到30%。嚴(yán)重地威脅著女性的生命健康［1-2］。卵巢癌的發(fā)病受多種因素影響，其中遺傳易感性是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。研究表明卵巢癌的發(fā)病是多基因的聯(lián)合作用，篩選卵巢癌相關(guān)基因并對(duì)其作用進(jìn)行研究有助于探討卵巢癌發(fā)生的機(jī)理。已有報(bào)道c - myc、p53、BRCA1 和BRCA2 等基因與卵巢癌的發(fā)病密切相關(guān)［3-5］。

人類白細(xì)胞抗原(huaman leukocyte antigen，HLA)是人類的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，位于6 號(hào)染色體短臂上，包括一系列緊密連鎖的基因座，在免疫識(shí)別及遺傳控制中起到重要的作用［6］。MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)基因A(MHC class I chain-related gene A，MICA)位于HLA 復(fù)合體中I 類HLA -B位點(diǎn)上游46 kb，與HLA -B 基因位點(diǎn)緊密連鎖，編碼跨膜區(qū)的第5 外顯子具有(GCT)n 微衛(wèi)星多態(tài)性［7-8］。微衛(wèi)星多態(tài)性主要表現(xiàn)為2 ～6 個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)。國(guó)內(nèi)外資料表明MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與某些腫瘤和自身免疫病相關(guān)［9-12］。本文將首次探討MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與卵巢癌發(fā)病的關(guān)系，從分子水平為卵巢癌的預(yù)防和診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 對(duì) 象

實(shí)驗(yàn)組包括95 名于2010年4月至2012年4月大連市婦產(chǎn)醫(yī)院確診的卵巢癌患者，平均年齡(50.25 ±10.92)歲。對(duì)照組包括同期99 名無(wú)血緣關(guān)系的遼寧漢族健康女性，平均年齡(48. 67 ±9.84)歲。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本DNA 提取:外周靜脈采血3 mL，EDTA抗凝。采用血液基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技公司，批號(hào)J8903)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取標(biāo)本基因組DNA。DNA 濃度調(diào)為50 ng/μL 左右，純度A260/A280 比率在1.6 ～1.9。

1.2.2 PCR 反應(yīng):采用primer 5 軟件設(shè)計(jì)MICA 基因第5 外顯子引物序列，由大連寶生物公司合成。MICA 基因的引物序列為上游:5’-CCTTTTTTTCAGGGAAAGTGC-3’，上游引物5’標(biāo)記熒光FAM，下游:5’-CCTTACCATCTCCAGAAACTGC-3’。20 μL PCR反應(yīng)體系包括:2 μL 10 ×PCR 緩沖液，0.25 mmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，100 ng 基因組DNA 和1U Taq DNA 聚合酶。反應(yīng)在PCR 擴(kuò)增儀ABI9700 上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后置于4 ℃終止反應(yīng)。

1.2.3 毛細(xì)管電泳:熒光標(biāo)記PCR 產(chǎn)物在ABI 310型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。Collection 軟件收集信息，GeneScan Analysis 3.1 軟件進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Hardy-Weinberg 平衡的吻合性檢驗(yàn)，等位基因頻率分析均使用Arlequin 3. 11 軟件計(jì)算。使用SPSS15.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因型分布均符合Hardy -Weinberg 平衡(P ＞0.05)。

2.2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性分布

兩組均檢測(cè)出5 種等位基因片段，分別為A4(179 bp)、A5(182 bp)、A5.1(183 bp)、A6(185 bp)和A9(194 bp)。兩組MICA 基因第5 外顯子等位基因頻率分布見(jiàn)表1。正常對(duì)照組MICA 第5 外顯子A5.1等位基因的頻率最高，為33.8%。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MICA 第5 外顯子A5 等位基因的頻率分別為31.1%和19.2%，差異有顯著性意義(P ＜0.01)，其他等位基因頻率分布差異均無(wú)顯著性意義(P ＞0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MICA 基因第5 外顯子等位基因頻率分布的比較Tab 1 Differences in allelic distributions of MICA gene polymorphism between patients and controls

3 討 論

HLA 基因位于人的第6 號(hào)染色體短臂，是人體內(nèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，也是機(jī)體內(nèi)特異性免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答的主要成分［6］。MICA 距HLA -B 位點(diǎn)最近，全長(zhǎng)11.7 kbp，整個(gè)基因包括6 個(gè)外顯子，其中第5 外顯子編碼跨膜區(qū)，有1 個(gè)(GCT)三核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)［7］。微衛(wèi)星是一類廣泛存在于各類真核生物基因組中的由1 ～6 bp串聯(lián)重復(fù)排列而成的DNA 順序，又被稱為短的串聯(lián)重復(fù)順序(STR)，其高度多態(tài)性源于串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)目在同種不同個(gè)體間的差別［13］。由于微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性好，因此在基因的定位、人類疾病診斷及預(yù)測(cè)、親權(quán)分析、進(jìn)化研究等領(lǐng)域中都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前，MICA 基因第5 外顯子已發(fā)現(xiàn)A4(179 bp)、A5(182 bp)、A5.1(183 bp)、A6(185 bp)和A9(194 bp)共5 種等位基因片段，其中A5.1 是在A5的基礎(chǔ)上插入一個(gè)堿基G，而導(dǎo)致移碼突變。國(guó)內(nèi)外資料表明MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與頭頸鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等腫瘤和糖尿病等自身免疫病相關(guān)［9-12］。本研究結(jié)果表明MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與卵巢癌的發(fā)病相關(guān)，A5 等位基因增加了卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性分布在不同群體間存在種族差異［14-15］。1997年Ota 等［15］首先對(duì)9 個(gè)群體進(jìn)行了MICA 第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性研究，其中中國(guó)回族、哈薩克斯坦和日本群體中最常見(jiàn)的等位基因?yàn)锳5，維吾爾族、伊朗和意大利等群體以A6 最為常見(jiàn)。MICA 基因第5外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性分布在中國(guó)漢族人群中存在地區(qū)差異［16-19］。中國(guó)南方上海、湖北、成都和云南地區(qū)漢族人群MICA 第5 外顯子的等位基因均以A5為主，其次為A5.1［16-18］。中國(guó)北方遼寧漢族人群MICA 第5 外顯子的等位基因均以A5.1 為主，其次為A5［19］。本文結(jié)果與范亞欣等［19］結(jié)果相同，遼寧地區(qū)漢族人群A5.1 最為常見(jiàn)(33.8%)，其次為A5(19.2%)。人類疾病均直接或間接與遺傳有關(guān)。不同人群的遺傳背景不同，他們對(duì)某些疾病的遺傳易感性也不同。林健［12］報(bào)道I 型糖尿病(T1DM)是一種具有多基因遺傳背景的自身免疫性疾病，MICA基因遺傳多態(tài)性與T1DM 發(fā)病和進(jìn)展緩急相關(guān)，但在不同的種族其易感性和保護(hù)性基因型不完全一致，并且這種作用是獨(dú)立于其他T1DM 易感基因如人類白細(xì)胞抗原(HLA)DR/DQ。其他地區(qū)或種族人群MICA 基因第5 外顯子微衛(wèi)星多態(tài)性與卵巢癌的相關(guān)性研究還需進(jìn)一步探索。

MICA 微衛(wèi)星多態(tài)性與某些腫瘤相關(guān)，可能與它們和HLA 經(jīng)典的I、II 類位點(diǎn)的連鎖不平衡有關(guān)［10-11］。文獻(xiàn)報(bào)道西班牙乳腺癌患者M(jìn)ICA -A5.1與HLA-B7 單倍型的頻率顯著高于健康對(duì)照組［11］。MICA 和HLA 其他位點(diǎn)的單倍型與卵巢癌的關(guān)系也需要深入的探討。

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