侯劍峰，劉學(xué)彬，叢祥鳳，胡盛壽，陳 曦

·基礎(chǔ)研究·

溶血磷脂酸預(yù)處理提高心肌梗死區(qū)移植干細(xì)胞存活的實(shí)驗(yàn)研究

侯劍峰，劉學(xué)彬，叢祥鳳，胡盛壽，陳 曦

目的探討溶血磷脂酸（LPA）預(yù)處理對(duì)心肌梗死后間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植早期存活率的影響。方法MSCs取自雄性SD大鼠，缺氧無血清條件下LPA預(yù)處理MSCs，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作雄性SD大鼠心肌梗死（MI）模型。3周后，經(jīng)超聲篩選合格MI大鼠隨機(jī)分為3組：① 培養(yǎng)基（DMEM）注射組：心肌梗死區(qū)細(xì)胞培養(yǎng)基注射（n＝24）；②MSCs組：心肌梗死區(qū)雄性MSCs注射（n＝26）；③L－MSCs組（n＝27）：心肌梗死區(qū)LPA預(yù)處理的雄性MSCs注射組，細(xì)胞注射量為2×106。Real time－PCR技術(shù)檢測(cè)SRY基因（Y染色體），TUNEL的方法評(píng)價(jià)移植細(xì)胞凋亡，免疫組化檢測(cè)毛細(xì)血管密度，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心功能。結(jié)果LPA預(yù)處理顯著提高了缺氧無血清條件下MSCs的VEGF分泌；與單獨(dú)MSC移植相比，LPA預(yù)處理顯著提高了移植MSCs存活率［1 h：（50．93±11．43）%vs．（23．63±2．24）%，P＝0．28；1 d：（34．96±12．1）%vs．（14．75±1）%，P＝0．31；1周：（1．38±0．35）%vs．（0．69±0．14）%，P＝0．44］；減少了移植MSCs凋亡，同時(shí)促進(jìn)了局部毛細(xì)血管的新生，但沒有獲得心功能的顯著改善。結(jié)論LPA預(yù)處理能夠提高移植MSCs存活，增強(qiáng)其旁分泌作用，促進(jìn)血管的發(fā)生，是一種有效地提高M(jìn)SCs移植存活的策略。

溶血磷脂酸；干細(xì)胞移植；存活；凋亡；心肌梗死；大鼠

1 資料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)Sprague－Dawley（SD）大鼠，均由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280 g。MSCs取自雄性SD大鼠，缺氧無血清條件下LPA預(yù)處理第3代MSCs，移植前4＇，6－二脒基－2－苯基吲哚鹽酸（4’，6－diamidino－2’－phe－nylindole，DAPI）標(biāo)記。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型；3周后，使用超聲心動(dòng)圖篩選大鼠心肌梗死模型（左心室短軸縮短率＜30%，左心室射血分?jǐn)?shù)＜60%）將存活大鼠90只隨機(jī)分為三組，每組30只完成第二次手術(shù)［2］：①培養(yǎng)基（DMEM）注射組：心肌梗死區(qū)細(xì)胞培養(yǎng)基注射30 μl（n＝24）；②MSCs組：心肌梗死區(qū)雄性MSCs單點(diǎn)注射（n＝26），細(xì)胞注射量為2×106／只；③L－MSCs組（n＝27）：心肌梗死區(qū)LPA預(yù)處理的雄性MSCs單點(diǎn)注射，細(xì)胞注射量為2×106／只。

1．2 觀察指標(biāo) ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。移植后1 h、1 d、1周，Real－time PCR定量Y染色體基因（sex determining region on Y，SRY）評(píng)價(jià)細(xì)胞存活，SRY基因的引物序列為：上游引物：5’－CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA－3’，下游引物：5’－ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC－3’［2］；移植后1天采用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)心肌組織中移植后MSCs凋亡情況；移植后1周，免疫組化檢測(cè)血小板／內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子－1（platelet／endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1）（CD31）評(píng)價(jià)毛細(xì)血管密度，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟功能。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，α＝0．05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量 Hypoxia／SD條件下隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組培養(yǎng)液上清中VEGF含量隨時(shí)間延長呈增加趨勢(shì)，LPA（10 μM）處理的L－MSCs組培養(yǎng)液上清中VEGF的含量在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（1 h，3 h，6 h，12 h）均顯著高于單純培養(yǎng)的DMEM組，具體結(jié)果如表1所示。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液上清中VEGF含量（n＝30，s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液上清中VEGF含量（n＝30，s）

注：與對(duì)照組比較*P＜0．05

組別 1 h 3 h 6 h 12 h DMEM組（ng／L） 31．3±2．5 47±2．6 67．3±4．7 109．6±3．5 L－MSCs組（ng／L） 35±3．1*61±3．6*84．7±3．1*148．3±7．1*

圖1 Real－time PCR定量分析MSCs移植后存活率

2．2 Real－Time PCR定量SRY基因 所有細(xì)胞和心肌組織提取的DNA質(zhì)量完好，OD260／OD280比值均在1．7～1．9之間。在DMEM組中沒有檢測(cè)到SRY基因。如圖1所示：SRY基因擴(kuò)增曲線平行性好，每次擴(kuò)增曲線之間相差3．3個(gè)Ct值左右，根據(jù)Ct值和雄性MSCs細(xì)胞數(shù)之間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝－3．51x＋16．91；相關(guān)系數(shù)R2＝0．9992。通過SRY基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方程計(jì)算存活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞移植1 h，L－MSCs組存活細(xì)胞比例約為最初移植總數(shù)的（50．93±11．43）%，其大約為MSCs組存活細(xì)胞數(shù)目的兩倍（23．63±2．24）%，（P＝0．011），移植后1 d和1周，L－MSCs組存活的MSCs比例1 d：（34．96±12．1）% vs．（14．75±1）%（P＝0．037）；1周：（1．38±0．35）%vs．（0．69±0．14）%（P＝0．042），均高于MSCs組。

2．3 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞移植后1 d，組織冰凍切片經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢在移植區(qū)域內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)如圖2所示：移植的MSCs由于DAPI標(biāo)記而發(fā)出藍(lán)色熒光，在DMEM組中未見標(biāo)記細(xì)胞，TUNEL陽性的細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光。細(xì)胞移植后1 d，L－MSCs組TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞的比例明顯低于MSCs組（6±2）% vs．（16±3．61）%（P＝0．024）。

圖2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞移植后1 d兩組MSCs凋亡發(fā)生率

2．4 新生毛細(xì)血管密度 如圖3所示，細(xì)胞移植后1周，DMEM組、MSCs組、L－MSCs組心肌缺血區(qū)的毛細(xì)血管密度分別為（16．33±2．52）個(gè)／0．2 mm2、（25．0 ±3．61）個(gè)／0．2 mm2和（31．33±3．06）個(gè)／0．2 mm2，MSCs組新生毛細(xì)血管密度顯著高于 DMEM組（P＝0．034），這種顯著提高的局部毛細(xì)血管新生現(xiàn)象在L－MSCs組被強(qiáng)化（vs．DMEM組，P＝0．008；vs．MSCs組，P＝0．044）。

2．5 心功能評(píng)價(jià) 細(xì)胞移植后1周對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)評(píng)價(jià)心功能。如表2所示，LMSCs組的左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率高于MSCs移植組和DMEM注射組；L－MSCs組左心室收縮末徑和左心室舒張末徑較其他兩組也獲得了改善的趨勢(shì)，但是，以上數(shù)值的改善均未獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 三組超聲心動(dòng)圖左心室功能指標(biāo)比較（n＝30，?s）

3 討 論

本研究旨在心肌梗死動(dòng)物模型中探究LPA預(yù)處理對(duì)移植MSCs存活的影響，主要發(fā)現(xiàn)有：①在缺氧無血清條件下，LPA能夠促進(jìn)MSC分泌VEGF；②LPA預(yù)處理在MSCs移植到缺血心肌后不同的時(shí)間點(diǎn)（1 h，1 d，1周）明顯增強(qiáng)了移植細(xì)胞存活；③ 移植LPA預(yù)處理的MSCs在移植后1周促進(jìn)了血管的新生。

研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死區(qū)細(xì)胞移植后，由于缺血、失巢凋亡以及炎癥反應(yīng)等因素，大部分細(xì)胞在移植后數(shù)天之內(nèi)發(fā)生死亡，限制了MSCs的治療作用［3］。Muller－Ehmsen等人用Real－time PCR的方法對(duì)移植后供體細(xì)胞的存活情況作了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠慢性缺血性心肌病模型中移植的MSCs在移植后1 h左右時(shí)，存活率為（25．8±15）%，移植2 d后，存活率為（27．6±8．3）%，而移植5 d后，存活率僅存（4．6±3．9）%［4］。在本研究中，MSCs移植1 h后，Real－time PCR方法檢測(cè)到（23．63±2．24）%的細(xì)胞存活；移植1 d和1周后，分別還有（14．75±1）%和（0．69±0．14）%的細(xì)胞存活；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LPA預(yù)處理顯著提高了移植MSCs的存活，約為單純移植MSCs存活的2倍左右。

在本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LPA通過能夠拮抗Hypoxia／SD條件誘導(dǎo)的凋亡作用促進(jìn)細(xì)胞存活［1］。已有研究表明，移植到心肌梗死區(qū)的供體細(xì)胞的凋亡高峰在移植后1 d左右，而在1周之后很少再有細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5］。因此，本研究選擇了移植后1 d作為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，TUNEL檢測(cè)比較移植到缺血心肌的MSCs的凋亡情況發(fā)現(xiàn)：MSCs移植1 d后，大約一半的移植細(xì)胞由于凋亡而丟失，這一結(jié)果與Nakamura等人的研究結(jié)果相似［6］；而LPA預(yù)處理后，這種凋亡現(xiàn)象的發(fā)生明顯少于MSCs組，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的Real－time PCR數(shù)據(jù)，可以初步推斷LPA預(yù)處理在體內(nèi)對(duì)MSCs也產(chǎn)生了抗凋亡作用進(jìn)而促進(jìn)了移植細(xì)胞的存活。

MSCs移植后的旁分泌效應(yīng)，特別是促進(jìn)局部血管新生作用是其改善梗死后心臟功能的重要機(jī)制之一［7］。在本研究發(fā)現(xiàn)LPA預(yù)處理的MSCs在缺氧無血清處理后，能夠分泌比單純?nèi)毖鯚o血清處理更多的VEGF；同時(shí)，在心肌梗死邊帶區(qū)，LPA預(yù)處理組移植的MSCs獲得了更多的新生毛細(xì)血管。筆者分析主要原因是由于更多存活的MSCs能夠釋放更多的細(xì)胞因子和血管活性因子［8］。但是，與既往研究結(jié)果不同［9］，在本實(shí)驗(yàn)中并未獲得與MSCs移植有關(guān)的心功能改善，分析其原因，認(rèn)為選擇了1周作為心功能評(píng)價(jià)時(shí)間點(diǎn)，移植的MSCs很難在短暫的時(shí)間內(nèi)迅速發(fā)揮其療效；此外，本研究為減少細(xì)胞移植后經(jīng)針道的細(xì)胞丟失選擇單點(diǎn)注射，在單個(gè)點(diǎn)內(nèi)能夠移植的細(xì)胞數(shù)量有限，也會(huì)影響移植療效。

總之，本研究初步證實(shí)：LPA預(yù)處理能夠顯著提高移植MSCs的存活率，促進(jìn)了移植區(qū)毛細(xì)血管密度的增加。迅速有效地提高心梗區(qū)LPA含量或者使用LPA類似功能的藥物將會(huì)是一種新的有效地抗移植MSCs凋亡的治療策略，其對(duì)臨床提供了重要的理論依據(jù)。

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［3］ Matar AA，Chong JJ．Stem cell therapy for cardiac dysfunction［J］．Springerplus，2014，3：440．

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Preconditioning by lysophosphatidic acid enhancing early survival of implanted mesenchymal stem cells following myocardial infarction

Hou Jian－feng，Liu Xue－bin，Cong Xiang－feng，Hu Sheng－shou，Chen Xi
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China

Chen Xi，Email：chenxifw＠aliyun．com．cn

ObjectiveTo evaluate the effects of lysophosphatidic acid（LPA）preconditioning on early survival of implanted mesenchymal stem cell（MSCs）in rat models of myocardial infarction（MI）．MethodsMale SD rat MSCs were prepared and subjected to hypoxia and serum deprivation．The secretion of vascular endothelial growth factor（VEGF）from MSCs were evaluated by ELISA．MI model was induced by left coronary artery ligation in female SD rats．Three weeks later，the qualified animals were allocated randomly to 3 groups，1．DMEM group：to receive intramyocardial injection with 30 μl DMEM，2．MSCs group：to receive intramyocardial injection with 2×106male rat MSCs，and 3．L－MSCs group：to receive intramyocardial injection with 2×106LPA－preconditioning male MSCs．Cell survival was assayed with quantitative real－time polymerase chain reaction to identify Y chromosome gene and apoptosis was assayed with TUNEL staining．Capillary density was estimated by the immunohistochemistry．The echocardiogram（UCG）was used to evaluate the heart function．ResultsLPA（10 μM）enhanced VEGF release from MSCs under hypoxia／SD in vitro．Compared with MSCs group and DMEM group，although there was no difference in the improved heart function，LPA preconditioning significantly enhanced early cell survival rate by nearly 2－fold（1 hour：50．93±11．43%vs．23．63±2．24%，P＝0．28；1 day：34．96±12．1%vs．14．75 ±1%，P＝0．31；1 week：1．38±0．35%vs．0．69±0．14%，P＝0．44），and decreased the apoptotic percentage of implanted MSCs in infarcted myocardium thus increased the number of newly formed capillaries．ConclusionLPA preconditioning could be a novel approach for cell transplantation to enhance the early cell survival and the therapeutic potential．

Lysophosphatidic acid；Stem cell transplantation；Survival；Apoptosis；Myocardial infarction；Rat細(xì)胞移植已成為心肌梗死治療的新策略，但是移植后干細(xì)胞存活率低下極大限制了該策略的療效。在前期細(xì)胞研究中筆者發(fā)現(xiàn)：溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）預(yù)處理能夠拮抗缺氧無血清（hypoxia and serum deprivation，hypoxia／SD）誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）凋亡［1］。本研究旨在活體動(dòng)物水平觀察LPA預(yù)處理對(duì)心肌梗后MSCs移植早期存活率的影響并對(duì)初步探討可能機(jī)制。

2014-10-23）

2014-11-15）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．2015．01．17

北京市科技新星計(jì)劃（Z111107054511080）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃（2013D009008000004）；協(xié)和青年科研基金項(xiàng)目（2013XHQN03）

100037北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國家心血管病中心阜外心血管病醫(yī)院心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

陳曦，Email：chenxifw＠aliyun．com．cn