馬 潔，汪順才，朱夢琪，馬久明，周 華，虞臘青，楊永峰，經(jīng)繼生

檢測GPC3和GP73兩種方法的比較及與臨床的相關(guān)性

馬 潔1，汪順才2，朱夢琪3，馬久明2，周 華2，虞臘青2，楊永峰4，經(jīng)繼生2

摘要采用ELISA法檢測70例標(biāo)本（肝癌組39例、肝硬化組31例）血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）和高爾基體蛋白73（GP73）的水平，qRT-PCR法檢測相同標(biāo)本外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相對表達量。結(jié)果顯示肝癌組血清中GPC3和GP73表達量顯著高于肝硬化組（P＜0.0 001）；兩組間PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝硬化組和肝癌組血清中GPC3、GP73含量均有正相關(guān)性（P＜0.01）。血清中GPC3和GP73的水平均能預(yù)測原發(fā)性肝癌，且GPC3和GP73的水平具有一定的相關(guān)性；PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表達水平不能很好的區(qū)分肝癌組與肝硬化組，提示ELISA法檢測血清中GPC3和GP73的表達水平是臨床預(yù)測原發(fā)性肝癌的首選方法。

關(guān)鍵詞原發(fā)性肝癌；高爾基體蛋白73；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；ELISA法；qRT-PCR法

2015-02-02接收

作者單位：1江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床生化檢驗系，鎮(zhèn)江 212013

2江蘇省句容市人民醫(yī)院感染病科，句容 212400

3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院傳染科肝病研究室，上海200040

4南京市第二醫(yī)院肝內(nèi)科，南京 156500

原發(fā)性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）在我國發(fā)病率逐年上升，目前常規(guī)甲胎蛋白（alpha fetaprotein，AFP）和超聲的檢查篩選方法敏感性、特異性均不能令人滿意；很多HCC患者臨床診斷時已失去有效的治療機會。近年來，各種有希望的新的腫瘤標(biāo)志物被相繼發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇聚糖-3（glypican3，GPC3）是肝癌的一種新的組織化學(xué)標(biāo)志物［1］。高爾基體蛋白73（Golgi protein 73，GP73）可作為肝癌潛在獨立的診斷指標(biāo)，如與AFP聯(lián)合檢測可提高肝癌的診斷效率［2-3］。該研究通過ELISA法檢測血清中GPC3和GP73的蛋白表達水平以及qRT-PCR法檢測外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中GPC3、GP73 mRNA的表達水平，比較兩者在診斷HCC中的應(yīng)用價值，用以判斷哪一種方法是臨床預(yù)測原發(fā)性肝癌的首選方法。

1　材料與方法

1.1 病例資料 收集2012年12月～2013年12月

句容市人民醫(yī)院與南京市第二醫(yī)院就診的70例患者（肝癌組39例、肝硬化組31例），診斷參照2000年病毒性肝炎防治方案［4］。肝癌的診斷參照2011年原發(fā)性肝癌診斷規(guī)范［5］。

1.2 觀察指標(biāo) 血清中GPC3、GP73的表達水平；PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表達水平。

1.3 入選與排除標(biāo)準(zhǔn) 均為乙型或丙型肝炎肝硬化患者，無其它肝炎病毒重疊感染，無自身免疫性肝炎重疊感染，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）水平正?；虍惓?，心、肺、腎功能正常。

1.4 方法

1.4.1 主要試劑及儀器 ALT、AST檢測采用美國貝克曼公司自動生化儀；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FSQ-101（日本Toyobo公司）；熒光定量試劑盒SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）；GPC3、GP73 ELISA檢測試劑盒（上海博研生物科技有限公司）。

1.4.2 ELISA法檢測GPC3、GP73表達水平 在ELISA板中加入準(zhǔn)備好的稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，每次5 min；加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次，每次5 min；加入顯色液A、B，37℃顯色10 min后加入終止液，15 min之內(nèi)讀取光密度（optical density，OD）值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（×5）；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（×5），即為樣品的實際濃度。

1.4.3 qRT-PCR法檢測GPC3、GP73 mRNA表達操作步驟：①PBMC的分離。取2 ml全血置于EDTA抗凝劑的試管中，加入等體積的PBS溶液混勻。另準(zhǔn)備一個干凈的10 ml離心管，加入4 ml人淋巴細(xì)胞分離液，在人淋巴細(xì)胞分離液面上1 cm處沿管壁徐徐加入血液與PBS的混合液。切記勿破壞液體界面。1 500 r／min離心20 min后，小心吸取云霧狀白膜層，即為PBMC。②將PBMC抽提總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進行目的基因PCR擴增。GPC3、GP73及β-actin qRT-PCR引物由本實驗室設(shè)計，上海生物工程有限公司合成。GPC3引物F：5′-GCCCATTCTCAACAACGC-3′；R：5′-CACT TTCAAACCCTTCCTCAT-3′；GP73 F：5′-CAGCGCT GATTTTGAGATG-3′；R：5′-ATGATCCGTGTCTGGAG GTC-3′）；β-actin F：5′-CGTACCACTG GCATCGT GAT-3′；R：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTT G-3′。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)用±s表示，性別采用χ2檢驗進行比較，年齡、ALT、AST采用Student’s t檢驗進行比較。

2　結(jié)果

2.1 病例基本情況 70例入選本研究的肝癌與肝硬化患者在性別、年齡上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組病例的臨床特征具有可比性，見表1。

表1　病例基本情況（n，±s）

表1　病例基本情況（n，±s）

項目　　肝癌組（n＝39）肝硬化組（n＝31）　t／χ2值　P值性別（n）男30　18　2.850　0.09 女9 13年齡（歲）　46.2±10.1　49.2±10.3　1.224　?。?.05 ALT（U／L）　105.2±15.2　104.2±13.1　0.290　　＞0.05 AST（U／L）128.2±23.8　116.2±30.1　1.863　?。?.05

2.2 血清中GPC3和GP73的表達 兩組患者血清中GPC3、GP73的檢測值比較，肝癌組：GPC3 （15.8±3.86）μg／L、GP73（107.46±29.5）ng／ml，肝硬化組：GPC3（7.51±1.38）μg／L、GP73（65.09 ±17.23）ng／ml。由此可見，肝癌組GPC3、GP73的檢測值高于肝硬化組（t＝20.77，P＜0.000 1），同時GP73的檢測值也高于肝硬化組（t＝8.405，P＜0.000 1）。見圖1。

2.3 PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表達水平兩組患者PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表達量比較，肝癌組：GPC3（16.94±8.67）μg／L、GP73（12.51 ±2.97）ng／ml，肝硬化組：GPC3（15.63±7.35）μg／L、GP73（14.25±3.67）ng／ml。肝癌組GPC3、GP73 mRNA的表達量與肝硬化組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

2.4 ELISA法檢測血清中GPC3、GP73含量的相關(guān)性 將肝硬化組血清中GPC3、GP73含量做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，兩種指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)r＝0.669 4，有顯著的正相關(guān)性（P＜0.000 1）；肝癌組血清中兩種指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)r＝0.464 5，有顯著的正相關(guān)性（P＝0.002 9）。見圖3。

3　討論

GPC3和GP73是近年來發(fā)現(xiàn)的與HCC密切相關(guān)的指標(biāo)，GPC3是1995年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外糖蛋白，是一種腫瘤抑制物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖［6］。正常人肝組織中不表達，提示可能在肝臟功能中發(fā)揮著重要作用［7］。研究［8-9］顯示在常規(guī)腫瘤標(biāo)志物未達到診斷水平的肝癌以及比較小的肝臟腫瘤的診斷中，GPC3可以起到很好的互補作用，同時GPC3的表達異常也用于HCC轉(zhuǎn)移的監(jiān)測。GP73是Kladney et al［10］發(fā)現(xiàn)的一個高爾基體二型跨膜蛋白，該研究發(fā)現(xiàn)GP73的表達與肝纖維化的嚴(yán)重程度成正相關(guān)性（肝纖維化的程度越重，GP73表達越高），患者從肝硬化發(fā)展成原發(fā)性肝癌時GP73的表達達到高峰，可以推測GP73高表達可能與肝癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Block et al［11］首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平顯著升高。

本研究中，ELISA法結(jié)果顯示，肝癌組血清中GPC3和GP73的含量均顯著高于肝硬化組，且兩組中GPC3和GP73兩個指標(biāo)之間均有顯著的正相關(guān)性，提示可以根據(jù)GPC3和GP73的水平作為診斷原發(fā)性肝癌的臨床指標(biāo)。qRT-PCR法結(jié)果顯示，根據(jù)PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表達水平無法區(qū)分肝癌組和肝硬化組。qRT-PCR法所需的檢測標(biāo)本—PBMC較難獲得，整個操作過程技術(shù)條件要求高，費用昂貴，不適宜基層醫(yī)療單位開展。相

比較而言，ELISA法簡單，所需檢測標(biāo)本（血清）比較容易獲得，患者所付出費用明顯降低，同時對基層醫(yī)療單位設(shè)備的要求可操作性也低。

參考文獻

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Comparing two detection methods of GPC3 and GP73 and the correlation with clinic

Ma Jie1，Wang Shuncai2，Zhu Mengqi3，et al
（1School of Medicine，Jiangsu University，ZhenJiang 212013；2Dept of Infectious Diseases，Jurong People′s Hospital，Jurong 212400；3Dept of Infectious Diseases Liver Research，Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040）

AbstractELISA and qRT-PCR were used to detect the level of glypican3（GPC3）and Golgi protein 73（GP73）of 70 patients［primary hepatocellular carcinoma（HCC）group 39 patients and cirrhosis group 31 patients］in serum and peripheral blood mononuclear（PBMC）respectively.The results showed that the expression levels of GPC3 and GP73 in serum had significant difference between two groups（P＜0.001），but the relative expression of GPC3 and GP73 mRNA in PBMC had no great difference.Correlation analysis showed that the expression levels of GPC3 and GP73 in serum were positively correlated（P＜0.01）.In conclusion，the expression levels of GPC3 and GP73 in serum can predict HCC，and the levels of GPC3 and GP73 have some relevance.GPC3 and GP73 mRNA levels in PBMC can′t distinguish between two groups，suggesting ELISA is the preferred method of clinical to detect the expression levels of GPC3 and GP3 in serum of HCC.

Key wordsHCC；GPC3；GP73；ELISA；qRT-PCR

作者簡介：馬 潔，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jsdxmajie＠163.com；經(jīng)繼生，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：jrjjs2008＠sina.com

基金項目：江蘇省衛(wèi)生廳自然科學(xué)基金項目（編號：Y201311）；江蘇大學(xué)臨床科技發(fā)展基金項目（編號：JLY20120103）

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0707-04

中圖分類號R 512