唐小梅，伍參榮，杜卓，楊維青，萬學勤，朱春霞

（1.廣東醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣東東莞523808；2.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南長沙410007；3.佛山科學技術學院藥學系，廣東佛山528000）

戊己丸水煎液對幽門螺桿菌感染SGC-7901細胞形態(tài)及凋亡的影響

唐小梅1，伍參榮2，杜卓3，楊維青1，萬學勤3，朱春霞3

（1.廣東醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，廣東東莞523808；2.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南長沙410007；3.佛山科學技術學院藥學系，廣東佛山528000）

摘要：目的在體外研究戊己丸水煎液對幽門螺桿菌誘導的SGC- 7901細胞形態(tài)及凋亡的作用。方法以SGC- 7901細胞作為幽門螺桿菌株感染的體外細胞模型，用不同濃度的戊己丸水煎液干預，倒置顯微鏡觀察SGC- 7901細胞的形態(tài)；流式細胞儀分析胃上皮細胞SGC- 7901的凋亡百分率。結果戊己丸水煎液加入幽門螺桿菌感染的細胞后，受損細胞出現(xiàn)修復；不同濃度戊己丸水煎液均可以減少幽門螺桿菌誘導的SGC- 7901細胞的凋亡,與陰性對照組比較差異有顯著性（p<0.05）。結論戊己丸水煎液能降低幽門螺桿菌感染的SGC- 7901細胞的凋亡率；對幽門螺桿菌感染的SGC- 7901細胞的形態(tài)有保護作用。

關鍵詞：戊己丸水煎液；SGC- 7901細胞；幽門螺桿菌；凋亡

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，H·pylori）與許多慢性胃部疾病，特別是與胃癌的發(fā)生密切相關。目前，H·pylori的感染居高不下，臨床采用抗生素抑殺H·pylori已成為基本的治療原則，但抗生素治療帶來耐藥菌株等副作用，故尋找非抗生素療法勢在必行。

中成藥戊己丸源自宋代《太平惠民和劑局方》，收錄于中國藥典2010版，是臨床治療消化性胃潰瘍、胃炎的經典方劑。體外抑菌實驗發(fā)現(xiàn)黃連、吳茱萸及戊己丸的水煎液均對H·pylori有明顯的抑制作用［1］，但戊己丸防治H·pylori感染的機理尚不明確。本文通過體外試驗探討戊己丸對H·pylori感染所致胃部疾病的作用機理。

1　材料與方法

1.1材料

H·pylori悉尼國際標準菌株SS1（sydneystrain 1），湖南中醫(yī)藥大學伍參榮教授惠贈。

胃腺癌SGC- 7901細胞，本實驗室凍存。

戊己丸水煎液，按原方比例稱取藥材，由廣東醫(yī)學院中藥與新藥研究所制備，濃度為1 g/mL。

布氏培養(yǎng)基、小牛血清來自青島海博生物技術有限公司；無菌脫纖維羊血來自廣州蕊特生物有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液來自美國Gibcobrl；胰酶來自瑞士Roche公司；其余試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1H·pylori菌懸液的制備

在無菌條件下，將復蘇的H·pylori菌均勻涂布于布氏羊血培養(yǎng)基平板上，于37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)，3～5 d后收集針尖樣透明菌落，用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（不加雙抗）作稀釋液，將細菌的濃度調整為1×108CFU/mL。

1.2.2不同濃度戊己丸水煎液的制備

用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（不加雙抗）作稀釋液，將戊己丸水煎液的濃度分別稀釋為1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280。

1.2.3細胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

首先在96孔細胞培養(yǎng)板上，采用常規(guī)培養(yǎng)基即RPMI 1640培養(yǎng)液加20%小牛血清及雙抗，于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每周換液3次，待細胞鋪滿底后，用0.25%胰酶消化成單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，取對數生長期細胞進行實驗。然后將稀釋好的不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液加入細胞中，藥液每孔加180 μL，菌懸液每孔加20 μL，每孔液體體積200 μL，每個藥液濃度重復8孔，在37℃微需氧條件下培養(yǎng)。24 h后，取出細胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4細胞凋亡的分析（流式細胞儀）

以1×105個/mL將細胞轉種至小青霉素瓶，每瓶1 mL，于37℃CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每周換液3次，選取長滿單層且生長良好的的細胞進行實驗。用Hank’S液清洗細胞2次，然后加入已經稀釋好的不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液，藥液每瓶加0.9 mL，菌懸液每瓶加0.1 mL，每瓶液體體積1 mL，每個藥液濃度重復8瓶，在37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)。24 h后用70%乙醇固定22 h。固定好后，用PBS反復洗3次，細胞重懸于PI染液（PI終濃度為50 ug/mL）中，37℃孵育30 min進行流式分析。

1.2.5統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5分析，測得指標都采用均數±標準差（x±s）表示。

2　結果

2.1戊己丸水煎液對H·pylori感染SGC-7901細胞形態(tài)的影響

不加細菌的SGC- 7901細胞在倒置顯微鏡下觀察生長良好，呈多角形，貼壁生長，細胞之間連接緊密，如見圖1所示。

加入H·pylori菌懸液感染后，細胞變圓，貼壁細胞減少，懸浮細胞增多，細胞周圍出現(xiàn)碎片，細胞間的連接較少甚至消失，細胞核和細胞質之間分界模糊，呈現(xiàn)核質融合狀態(tài)，觀察到細胞壞死，如圖2所示。

戊己丸水煎液加入H·pylori菌感染的細胞后，貼壁細胞和細胞間的連接明顯增多，部分受損細胞出現(xiàn)修復如圖3、4所示。

圖1　正常SGC-7901細胞40×10細胞生長良好、呈多角形

圖2　H·pylori感染SGC-7901細胞40×10細胞融合、發(fā)暗、變圓、壞死

圖3　戊己水煎液濃度1︰160 40×10 無H·pylori細胞修復

圖4　戊己水煎液濃度1︰320 10×10仍有細胞壞死、部分細胞修復

2.2戊己丸水煎液對H·pylori感染SGC-7901細胞凋亡的影響

在細胞中加入不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液，培養(yǎng)后流式細胞儀分析SGC- 7901細胞凋亡百分率結果如表1所示。

表1　戊己丸水煎液對H·pylori感染SGC-7901細胞凋亡率的影響

表1顯示，濃度為1∶160、1∶320、1∶640的戊己丸水煎液均可以減少H·pylori誘導的SGC- 7901細胞的凋亡，與陰性對照組比較差異有顯著性（p<0.05）。

3　討論

H·pylori感染與胃粘膜上皮細胞凋亡的關系是近年來的研究熱點。細胞凋亡在調節(jié)機體發(fā)育、維持內環(huán)境的穩(wěn)定以及抵御外界各種因素的干擾方面起著關鍵的作用，凋亡失控與包括腫瘤在內的許多重大疾病有著密切的聯(lián)系［2-3］。胃癌的發(fā)生與多種因素有關，細胞周期及細胞凋亡調節(jié)失控是導致細胞過度增殖促進腫瘤發(fā)生的重要因素。實驗中發(fā)現(xiàn)H·pylori可以誘導細胞凋亡率的增加，誘導細胞變圓、融合、壞死。加入不同濃度戊己丸水煎液后均可不同程度降低H·pylori感染SGC- 7901細胞的凋亡率，細胞形態(tài)出現(xiàn)修復現(xiàn)象。實驗表明，戊己丸水煎液可能通過抑殺H·pylori，從而保護感染細胞不壞死，使凋亡率明顯降低。

H·pylori感染誘導胃粘膜上皮細胞凋亡由Moss［4］等最先報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，H·pylori感染細胞的凋亡率隨細菌密度增加而呈濃度依賴性升高的趨勢，該結果提示SGC- 7901細胞發(fā)生的凋亡是由H·pylori感染直接誘導所致，其凋亡率與H·pylori的依從性關系呈濃度依賴性，這與Wagner［5］、Chen［6］等的報道相符。姚紅［7］和吳鶯等［8］的體外實驗也表明，H·pylori感染能引起胃上皮細胞的凋亡。楊藝等［9-10］在體外觀察到，當H·pylori高濃度作用于上皮細胞時，H·pylori的致細胞空泡毒作用和促細胞凋亡作用占優(yōu)勢，將可能使胃粘膜出現(xiàn)損傷，H·pylori以濃度依賴方式誘導胃上皮細胞凋亡，這一論點支持本實驗的結果與推測。

本實驗的研究結果顯示，戊己丸水煎液對H·pylori感染的SGC- 7901細胞的保護，可能是通過抑殺H·pylori、抑制細胞凋亡而實現(xiàn)的。是否還有其他機制，還有待進一步深入的研究。

參考文獻：

［1］唐小梅,伍參榮.戊己水煎液在體外對幽門螺桿菌的抑制作用［J］.中醫(yī)藥學刊, 2005, 23（4）: 703- 704.

［2］RUSCONI J C, HAYSR, CAGANR L. Programmed cell death and pathwayin Drosophila［J］. Cell Death Differ, 2000, 7（1）: 1063- 1070.

［3］SAVILLJ, FADOKV. Corpse clearance defines the meaningofcell death［J］. Nature, 2000, 407（6805）: 784- 788.

［4］MOSS S F, CALAMJ, AGARWAL B, et al. Induction of gastric epithetial apoptosis by Helicobacter pylori［J］. Gut, 1996, 48: 498- 501.

［5］WAGNER S, BEIL W, WESTERMAN J, et al. Regulation of gastric epithelial cell growth by Helicobacter pylori: evidence for a major fole ofapoptosis［J］. Gastroenterol, 1997, 113: 1836- 1847.

［6］CHEN G, SORDILLO E M, RAMEY W G, et al. Apoptosis in gastric epithelial cells is induced by Helicobacter pylori and accompanied byincreasd expression of BAK［J］. Biochem Biophys Res Comm, 1997, 239: 626- 631.

［7］姚紅,王健,郝素珍,等.幽門螺桿菌對SGC- 7901細胞增殖凋亡及p27kipl表達的影響［J］.中華微生物學和免疫學雜志, 2009, 29（6）: 517- 521.

［8］吳鶯,李翔,周紅,等.幽門螺桿菌對胃癌細胞BGC- 823形態(tài)及凋亡相關基因表達的影響［J］.世界華人消化雜志, 2011, 19（17）: 1767- 1772.

［9］楊藝,鄧長生,彭俊忠.幽門螺桿菌對體外培養(yǎng)的胃上皮細胞增殖與凋亡的影響［J］.中華微生物學與免疫學雜志, 2002, 22（1）: 10- 13.

［10］楊藝,鄧長生,姚學軍,等.幽門螺桿菌對胃上皮細胞系SGC- 7901細胞生長的影響［J］.中華消化雜志, 2001, 21（2）: 113- 114.

【責任編輯：任小平renxp90@163.com】

The influence of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori in vitro

TANGXiao- mei1, WUCan- rong2, DUZhuo3, YANGWei- qing1, WANGXue- qin3, ZHUChun- xia3
（1. School of Basic Medical Sciences, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China; 2. Medical School, Hunan Universityof Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 3. Department of Pharmacy, Foshan University, Foshan 528000, China）

Abstract:Objective To investigate the effecte of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori (H·pylori) in vitro. Methods H·pylori were introduced to the cells. Microscope was applied toobserve the morphologyand flowcytometrywas used toanalyze the extent ofapoptosis of cells infected with H·pylori. Results The morphology of cells infected with H·pylori was repaired with Wuji Pill Solution. The apoptosis of cells were lower than that of contrast group( p＜0.05). Conclution Wuji Pill Solution decreased the apoptosis rate of SGC- 7901 cells infected with H·pylori and protected the morphology of cells infected with H·pylori .

Keywords:Wuji Pill Solution; SGC- 7901 cell; Helicobacter pylori; apoptosis

作者簡介：唐小梅（1973-），女，山西大同人，廣東醫(yī)學院講師、碩士。

基金項目：湛江市科技攻關資助項目（2009C3101016）；廣東醫(yī)學院青年基金資助項目（XQ0713）；廣東醫(yī)學院面上基金資助項目（XK1445）；廣東省自然科學基金資助項目（S2012040007298）

收稿日期：2014-11-04

中圖分類號：R573.6

文獻標志碼：A

文章編號：1008- 0171（2015）04- 0067- 04