喻明，李鳳，聶本剛，蔣世杰，方登富，陳小容，何曉菲

·論著·

基質(zhì)金屬蛋白酶－9基因R279Q位點多態(tài)性與腦梗死初發(fā)及復發(fā)的相關(guān)性研究

喻明，李鳳，聶本剛，蔣世杰，方登富，陳小容，何曉菲

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP－9)基因R279Q位點多態(tài)性與腦梗死初發(fā)及復發(fā)的相關(guān)性。方法

腦梗死;基質(zhì)金屬蛋白酶9;多態(tài)性，單核苷酸;復發(fā)

腦梗死是指腦部血液供應障礙、腦組織缺血缺氧而導致的組織壞死及相應神經(jīng)功能缺損，占全部卒中的60%～80%［1］，動脈粥樣硬化是其最常見病因［2］。多數(shù)首發(fā)腦梗死患者經(jīng)及時治療能夠進入到恢復期和后遺癥期，但一旦復發(fā)則其癥狀重于初發(fā)時，且愈發(fā)難治，嚴重時可危及生命。在我國，腦梗死患者5年內(nèi)平均復發(fā)率在40%以上，防止腦梗死復發(fā)是當前國內(nèi)外研究的一個熱點問題。

腦卒中與基因多態(tài)性的關(guān)系是近年生命科學研究的熱點和重點，家族聚集性研究、雙生子研究、家系復合分離分析及遺傳模式分析等結(jié)果表明，腦卒中符合多基因遺傳規(guī)律，是一種多基因遺傳疾病。腦卒中具有較高的表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性，盡管國內(nèi)外已廣泛開展了該病的分子遺傳學研究，但得到公認的陽性結(jié)果不多，各項研究結(jié)論亦難以互相重復或驗證［3］。已有研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP－9)是缺血性腦血管病的獨立危險因素［4］，其基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化、心腦血管疾病密切相關(guān)。目前國內(nèi)外關(guān)于MMP－9基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性研究尚不多見，而關(guān)于MMP－9基因多態(tài)性與腦梗死初發(fā)及復發(fā)的相關(guān)性研究更是少之又少。本研究旨在探討MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性與腦梗死初發(fā)及復發(fā)的相關(guān)性，為腦梗死的防治提供參考。

1 對象與方法

1．1 研究對象選擇2012年4月—2014年4月在遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的初發(fā)腦梗死患者350例作為初發(fā)腦梗死組，復發(fā)腦梗死患者340例作為復發(fā)腦梗死組，同期在我院體檢健康者360例作為對照組。病例納入標準:初發(fā)腦梗死和復發(fā)腦梗死的診斷均符合全國第四屆腦血管病學術(shù)會議制定的診斷標準［5］，年齡≥18歲，腦梗死發(fā)病3 d內(nèi)入院，并經(jīng)臨床、顱腦CT和/或MRI檢查確診，行頸部血管彩超檢查(部分患者行顱腦MRA檢查)明確為TOAST分型中大動脈粥樣硬化性腦梗死［6］;復發(fā)性腦梗死患者需同時滿足以下條件:(1)出現(xiàn)新的神經(jīng)功能缺損癥狀;(2)本次發(fā)病癥狀較初發(fā)癥狀重，距第1次梗死時間＞1個月，并排除進展性卒中;(3)影像學檢查證實有新的缺血病灶。病例排除標準:(1)不合作者，患者或其家屬不同意參加本研究或拒絕留取標本;(2)合并動脈炎及其他類型血管炎、腦動脈畸形及心源性腦栓塞;(3)合并嚴重呼吸系統(tǒng)感染或其他嚴重感染;(4)合并嚴重肝臟疾病和/或肝功能損害;(5)合并嚴重腎臟疾病和/或腎功能損害(血肌酐＞220 μmol/L);(6)合并嚴重貧血(血紅蛋白＜80 g/L)或凝血功能障礙或其他嚴重血液系統(tǒng)疾病;(7)近期有創(chuàng)傷史、手術(shù)史、妊娠史、傳染性疾病及寄生蟲疾病史;(8)近6個月內(nèi)服用過降脂藥和/或雌激素、避孕藥;(9)合并嚴重內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病和/或惡性腫瘤。3組受試者間均無血緣關(guān)系，入組前均簽署知情同意書。

1．2 方法初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組患者于入院次日、體檢組受試者于體檢當日清晨空腹抽取肘靜脈血，檢測血糖、血脂、血清MMP－9水平等，血清MMP－9水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，試劑盒購自美國R＆D公司。MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)分析法:(1)DNA提取:將抽取的肘靜脈血置于抗凝管中，－80℃冰箱凍存，采用血液基因組提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供)抽提基因組DNA;(2)引物設計及合成:采用Primer 5．0軟件(加拿大Premier公司提供)進行引物設計，引物合成由上海生物工程有限公司完成，MMP－9基因R279Q位點上游引物序列為5'－TCACCCTCCCGCACTCTGG－3'，下游引物序列為5'－CGGTCGTAGTTGGCGGTGG－3'，擴增片段長度為300 bp;(3)PCR反應體系:10×buffer 2 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，上下游引物各1 μl，DNA模板0．1 μg，DNA聚合酶2 U，加ddH2O至20 μl，反應結(jié)束后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，采用凝膠成像儀檢測PCR產(chǎn)物特異性，PCR純化試劑盒(德國Qiagen公司生產(chǎn))純化PCR產(chǎn)物;(4)酶切反應:反應體系包括PCR純化產(chǎn)物1 μg，10×buffer 1 μl，MspⅠ內(nèi)切酶1．5 U(New England Biolabs公司生產(chǎn))，加ddH2O至10 μl，37℃酶切16 h，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析后，采用凝膠成像儀進行判定。

1．3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13．0軟件包進行統(tǒng)計分析，樣本群體代表性的檢測釆用Hardy－Weinberg平衡法;計量資料以(x±s)表示并進行正態(tài)性檢驗，均符合正態(tài)分布，采用方差分析;計數(shù)資料釆用χ2檢驗;各因素與初發(fā)腦梗死、復發(fā)腦梗死的相關(guān)性采用多因素Logistic回歸分析，以OR及其95%CI表示。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ內(nèi)切酶酶切后電泳結(jié)果顯示，MMP－9基因R279Q位點AA基因型可見300 bp基因片段，GG基因型可見170、130 bp基因片段，AG基因型可見300、170、130 bp基因片段。Hardy－Weinberg平衡法結(jié)果顯示，對照組、初發(fā)腦梗死組及復發(fā)腦梗死組受試者MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性具有群體代表性(χ2值分別為1．613、1．398、1．957，P＞0．05)。3組受試者基因型及等位基因分布比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組MMP－9基因R279Q位點GG基因型頻率及G等位基因頻率高于對照組，復發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表1)。

表1 3組受試者MMP－9基因R279Q位點基因型及等位基因分布〔n(%)〕Table 1 Genotypes and allelic genes of MMP－9 R279Q among the three groups

2．2 單因素分析結(jié)果3組受試者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、糖尿病發(fā)生率、飲酒率、總膽固醇、三酰甘油、HDL－C、空腹血糖比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);3組受試者高血壓發(fā)生率、吸煙率、LDL－C、MMP－9比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，見表2)。

2．3 多因素分析結(jié)果以初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組患者臨床特征及MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性為自變量，分別以腦梗死初發(fā)、腦梗死復發(fā)為因變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血清MMP－9水平增高是腦梗死初發(fā)的獨立危險因素〔OR=1．336，95% CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，但不是腦梗死復發(fā)的獨立危險因素〔OR=0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性是腦梗死初發(fā)〔OR=1．496，95%CI(1．028，2．159)，P= 0．007〕和腦梗死復發(fā)〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕的獨立危險因素。

表2 3組受試者臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data among the three groups

3 討論

腦梗死是一種多基因遺傳疾病，但目前其確切發(fā)病機制及具體病理生理過程尚不完全清楚。隨著人們生活水平提高及人口老齡化進程加劇，腦梗死發(fā)病率及復發(fā)率越來越高，因此，防止腦梗死發(fā)病及復發(fā)成為當前研究熱點。動脈粥樣硬化是腦梗死的最常見病因［2］，而MMP－9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，其過度表達可通過介導血管中膜平滑肌細胞遷移、增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)降解而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［7］。此外，MMP－9過度表達還可大量降解動脈粥樣硬化斑塊中纖維成分，導致斑塊破潰、脫落，最終導致腦梗死的發(fā)生［8］。多項研究表明，血漿MMP－9水平與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)，參與了缺血性腦卒中的發(fā)生、復發(fā)及出血轉(zhuǎn)化［9－10］。Alvarez等［11］研究認為，血清MMP－9水平與粥樣斑塊內(nèi)巨噬細胞水平相關(guān)，缺血性腦血管疾病患者血清MMP－9水平高于正常對照者。Graham等［12］研究發(fā)現(xiàn)，血清MMP－9水平可作為判斷動脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)及預測腦梗死發(fā)病的參考指標。本研究結(jié)果顯示，初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組患者血清MMP－9水平均高于對照組，且復發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組，血清MMP－9水平升高是腦梗死初發(fā)的獨立危險因素，提示MMP－9參與了腦梗死的發(fā)生，與之前文獻報道結(jié)果一致。

人MMP－9基因定位于20q11．2～13．1，全長7．7 kb，共含有13個外顯子和12個內(nèi)含子，其調(diào)控作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。目前已發(fā)現(xiàn)MMP－9基因存在多個序列變異，其中關(guān)于R279Q位點多態(tài)性的研究報道不多見。R279Q位點變異表現(xiàn)為MMP－9基因第6個外顯子的A被G取代，使mRNA編碼的谷氨酰胺變成了精氨酸，進而導致蛋白表達異常及血清MMP－9水平改變，繼而參與腦梗死的發(fā)生和發(fā)展。W?gs?ter等［13］研究證實，MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化過程中的細胞外基質(zhì)降解、血管中膜平滑肌細胞增殖、炎性細胞浸潤、斑塊破裂等病理過程有關(guān)，進而參與了腦卒中、冠心病及一些急性血管事件的發(fā)生。Blankenberg等［14］研究發(fā)現(xiàn)，MMP－9基因R279Q位點等位基因分布異?？蓪е卵錗MP－9水平增高，與心血管事件復合終點及非致命性心肌梗死的發(fā)生相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組MMP－9基因R279Q位點GG基因型頻率及G等位基因頻率高于對照組，復發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組，MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性是腦梗死初發(fā)和腦梗死復發(fā)的獨立危險因素，推測其可能作用機制為:MMP－9基因R279Q位點G等位基因頻率增高導致基因轉(zhuǎn)錄活性增加，導致MMP－9表達上調(diào)，過度表達的MMP－9一方面通過降解血管壁細胞外基質(zhì)而誘導巨噬細胞增殖、泡沫細胞形成及血管壁炎性反應，進而促進動脈粥樣硬化斑塊形成，另一方面還可破壞動脈粥樣硬化斑塊表面纖維帽而導致動脈粥樣斑塊破裂、血栓形成及機化，最終導致動脈粥樣硬化程度加重及斑塊擴大，誘發(fā)再次腦梗死，即復發(fā)。此外，腦梗死時血－腦脊液屏障被破壞、血管通透性增高也可導致MMP－9進入外周循環(huán)，繼而導致血清MMP－9水平升高。

綜上所述，MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性是腦梗死初發(fā)和腦梗死復發(fā)的獨立危險因素，MMP－9基因可能是一種潛在的腦梗死遺傳易感基因。但本研究樣本量有限，觀察指標還不夠完整、全面，關(guān)于MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性與腦梗死初發(fā)及復發(fā)的相關(guān)性還有待進一步開展多中心、大樣本、前瞻性研究進行深入探討。

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ObjectiveTo investigate the correlation between matrix metalloproteinase－9(MMP－9)gene R279Q polymorphism and first onset and recurrence of cerebral infarction．MethodsFrom April 2012 to April 2014 in the Department of Neurology，Suining Central Hospital，350 first onset cerebral infarction patients were selected as A group，340 recurrent cerebral infarction patients were selected as B group，and 360 healthy cases were seled as control group．Polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism(PCR－RFLP)method was used to analyze the MMP－9 gene R279Q polymorphism，enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the serum MMP－9 level．ResultsGG genotype frequency and G allele frequency of groups A and B were higher than those of control group，respectively(P＜0．05)，and those of A group were higher than those of B group(P＜0．05)．No significant differences of gender，age，BMI，incidence of diabetes，drinking rate，TC，TG，HDL－C，fasting blood glucose among the three groups(P＞0．05);while there was significant differences of incidence of hypertension，smoking rate，LDL－C，MMP－9 among the three groups(P＜0．05)．Multiple Logistic regression analysis showed that，higher serum MMP－9 level was an independent risk factor of first onset of cerebral infarction〔OR=1．336，95%CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，but was not of recurrence of cerebral infarction〔OR=0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9 gene R279Q polymorphism was an independent risk factor of first onset of cerebral infarction〔OR=1．496，95%CI(1．028，2．159)，P=0．007〕and recurrence of cerebral infarction〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕，respectively．ConclusionMMP－9 gene R279Q polymorphism is an independent risk factor of first onset and recurrence of cerebral infarction，MMP－9 gene may be a potential genetic susceptibility gene of cerebral infarction．

Brain infarction;Matrix metalloproteinase 9;Polymorphism，single nucleotide;Recurrence

R 743．33

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．012

2014－10－15;

2014－12－25)

(本文編輯:鹿飛飛)

四川省遂寧市科學與知識產(chǎn)權(quán)局項目(2014015)

629000四川省遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

選擇2012年4月—2014年4月在遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的初發(fā)腦梗死患者350例作為初發(fā)腦梗死組，復發(fā)腦梗死患者340例作為復發(fā)腦梗死組，同期在我院體檢健康者360例作為對照組，采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)分析法檢測MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清MMP－9水平。結(jié)果初發(fā)腦梗死組、復發(fā)腦梗死組MMP－9基因R279Q位點GG基因型頻率及G等位基因頻率高于對照組，復發(fā)腦梗死組高于初發(fā)腦梗死組(P＜0．05)。3組受試者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、糖尿病發(fā)生率、飲酒率、總膽固醇、三酰甘油、HDL－C、空腹血糖比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05);3組受試者高血壓發(fā)生率、吸煙率、LDL－C、MMP－9比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清MMP－9水平增高是腦梗死初發(fā)的獨立危險因素〔OR=1．336，95%CI(1．031，1．072)，P=0．028〕，但不是腦梗死復發(fā)的獨立危險因素〔OR= 0．609，95%CI(0．428，1．006)，P＞0．05〕;MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性是腦梗死初發(fā)〔OR=1．496，95%CI (1．028，2．159)，P=0．007〕和腦梗死復發(fā)〔OR=1．625，95%CI(1．072，2．566)，P=0．005〕的獨立危險因素。結(jié)論MMP－9基因R279Q位點多態(tài)性是腦梗死初發(fā)和腦梗死復發(fā)的獨立危險因素，MMP－9基因可能是一種潛在的腦梗死遺傳易感基因。

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Correlation between Matrix Metalloproteinase－9 Gene R279Q Polymorphism and First Onset and Recurrence of Cerebral InfarctionYU Ming，LI Feng，NIE Ben－gang，et al．Department of Neurology，Suining Central Hospital，Suining 629000，China