陳 楠， 文曉鵬*， 蔡永強(qiáng)， 劉 濤， 包九零

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省果樹研究所， 貴州 貴陽 550006)

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火龍果矮化突變體的遺傳分析

陳 楠1， 文曉鵬1*， 蔡永強(qiáng)2， 劉 濤2， 包九零1

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省果樹研究所， 貴州 貴陽 550006)

為了給火龍果的突變機(jī)制提供新信息，通過ISSR標(biāo)記、DNA甲基化及檢測赤霉素(GA3)含量等方法，對火龍果矮化突變體(D)及其回復(fù)突變體(R)進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明：對比野生型(WT)，D和R均帶有不同程度的刺座突變，同時均對GA3敏感，其中D的GA3含量極顯著低于WT，推測其為GA3缺陷型的矮化；篩選到3條有多態(tài)性差異的ISSR引物，D與WT存在有4個位點(diǎn)的差異，R與WT未找到差異位點(diǎn)；D的甲基化程度比WT高2.8%，而R的甲基化程度比WT低約0.9%。

火龍果； 矮化突變體； ISSR標(biāo)記； DNA甲基化； GA3缺陷型

火龍果又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、情人果等，屬仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)植物，其外形獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，是高維生素、低糖、低脂肪的保健食品，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。20世紀(jì)90年代初臺灣開始試種，近年來已陸續(xù)引種到廣西、廣東、海南、福建、云南、貴州等熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。目前，火龍果的種質(zhì)創(chuàng)新主要采用傳統(tǒng)的雜交育種[2]，而誘變育種可提高突變幾率，縮短育種年限，在梨、蘋果和柑橘上已取得較大成果[3]，在火龍果上的應(yīng)用也在逐步開展。如鄧仁菊[4]和張冰雪[5]探討了EMS對火龍果種子和幼苗的影響。貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院在前期工作中，采用EMS誘變獲得火龍果的矮化突變體，并通過組織培養(yǎng)得到回復(fù)突變體，但對其的遺傳分析尚未見報道。筆者擬通過ISSR標(biāo)記、DNA甲基化及檢測赤霉素(GA3)含量，對火龍果矮化突變體(D)及其回復(fù)突變體(R)進(jìn)行遺傳分析，旨在為探討火龍果的矮化突變機(jī)制提供新信息。

1 材料與方法

1.1 材料

由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存的火龍果品種紫紅龍(野生型，WT)及其矮化突變體(D)和回復(fù)突變體(R)試管苗。其中，D與WT為第一代至第五代，R為D在培養(yǎng)第三代產(chǎn)生，即第三代至第五代。

1.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定

取每種材料各30株剪下5 mm莖尖，轉(zhuǎn)至MS(100%)培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于20 d及40 d后，統(tǒng)計(jì)株高及刺座形態(tài)。

1.3 赤霉素測定及應(yīng)答處理

應(yīng)用雙抗體夾心法測定供試材料的赤霉素(GA3)含量，該試驗(yàn)委托上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)公司完成。取D及WT 5 mm莖尖各30株，接種在MS+1 mol/L GA3培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計(jì)株高及刺座形態(tài)。

1.4 ISSR檢測

取供試材料各100 mg，采用dp 305-3植物DNA提取試劑盒，提取基因組DNA，通過凝膠檢測DNA質(zhì)量，分光光度計(jì)檢測其濃度。

從52條ISSR引物中，篩選穩(wěn)定且可顯示清晰條帶的引物進(jìn)行遺傳差異性檢測。反應(yīng)體系共10 μL，其中,含20 ng/μL基因組DNA 0.5 μL,10 μmol/L引物0.5 μL,2×PCR mixPCR 5 μL,ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，特定退火溫度下退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相并記錄結(jié)果。

1.5 甲基化測定

分別用EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI組合對基因組DNA進(jìn)行酶切，連上接頭，應(yīng)用AFLP擴(kuò)增程序進(jìn)行2輪擴(kuò)增，產(chǎn)物加上樣緩沖液變性后，在6%的聚丙烯酰胺凝膠上檢測[6-7]。

將僅使用EcoRI/MspI酶切的樣品記為m泳道，僅使用EcoRI/HpaII酶切的樣品記為h泳道，將m泳道獨(dú)有而h泳道沒有的條帶數(shù)記為M，將h泳道獨(dú)有而m泳道沒有的條帶數(shù)記為H。總帶數(shù)=H+M+(m與h泳道共有條帶數(shù))，將外部胞嘧啶甲基化程度記為M%，將內(nèi)部胞嘧啶甲基化程度記為H%，M%與H%之和為該樣品總甲基化比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

由表1可見，不同材料的株高存在顯著差異(表1)。培養(yǎng)20 d時，矮化突變體D株高極顯著低于WT(約58%)，回復(fù)突變體R株高顯著低于WT(約10%)；培養(yǎng)40 d時，矮化突變體D株高極顯著低于WT(約85%)，回復(fù)突變體R株高極顯著低于WT(約16%)。因此，培養(yǎng)時間越長，D和WT的株高差值越大。同時，有96%的D及93%的R伴隨刺座的變異(圖1)，刺座并不生刺而是形成紅色的突起物，這種變異在WT上未發(fā)現(xiàn)。由此可見，矮化突變體D在株高突變時也產(chǎn)生刺座突變，R為D在株高水平上的回復(fù)，而刺座突變未回復(fù)。

表1 不同培養(yǎng)時間火龍果的株高

注：同列中不同大小寫字母分別表示1%和5%的顯著水平(下同)。

Note：Different capital and lowercase letters in the same column indicated 1% and 5% significant levels respectively. The same below.

2.2 火龍果的GA3含量與應(yīng)答反應(yīng)

由表2可見，不同突變體及不同繼代次數(shù)材料的GA3含量存在較大差異，在第1代和第5代中，矮化突變體D的GA3含量均極顯著低于同時期WT，而回復(fù)突變體R的GA3含量極顯著高于矮化突變體D及WT的同時卻有較高的標(biāo)準(zhǔn)差，這可能是由回復(fù)突變的不穩(wěn)定性造成。因此，GA3含量下降是導(dǎo)致矮化突變的重要原因。

注：A為矮化突變體D母株，B為野生型WT母株，C為第一代20 d及40 d的D與WT對比(由左至右為20 d D、20 d WT、40 d D、40 d WT)。

Note：A, stock plant of D; B, stock plant of WT; C, comparison of D and WT at 20 d and 40 d of the first generation(from left to right 20 d D, 20 d WT, 40 d D, 40 d WT).

圖1 不同時期火龍果矮化突變體與野生型的形態(tài)性狀

Fig.1 Comparison of the dwarf mutant and the wild ype in tdifferent period

表2 不同繼代次數(shù)火龍果的GA3含量

Table 2 The content of GA3of pitaya in different times of subculture pg/g

材料Material第1代Firstgeneration第5代Fifthgeneration矮化突變體D3170.22±57.78Bb3220.27±43.68Cc野生型WT3793.95±41.21Aa3689.20±39.95Bb回復(fù)突變體R-3959.38±89.10Aa

由表3可見，外施GA3的D與未施加GA3的WT在高度上無顯著性差異，而外施GA3使D極顯著高于未施加GA3的D(53%)。說明，D的矮化性狀可以通過外施GA3來矯正。

表3 施加GA3的火龍果及其對照(CK)培養(yǎng)20 d的株高

Table 3 The height of pitaya applied with GA3and the control(CK) after cultured for 20 days mm

材料Material外施GA3FoliagefertilizationofGA3CK矮化突變體D12.07±0.38Ab7.93±0.67Bc野生型WT12.80±0.49Aa11.20±0.47Ab

注：表中不同大小寫字母分別表示1%和5%的顯著水平。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicated 1% and 5% significant levels respectively.

2.3 火龍果的ISSR與MSAP檢測

由圖2可見，在28條可以顯示清晰條帶的引物中，共顯示96個標(biāo)記，其中僅有USC813、USC815和USC853的4個位點(diǎn)顯示矮化突變體D與WT的差異，而在R與WT間未檢測到差異譜帶。其中，USC813的差異位點(diǎn)為D獨(dú)有，而USC815和USC853的差異位點(diǎn)為D缺失。

圖2 火龍果DNA對應(yīng)引物USC813、USC815 及USC853的ISSR圖譜

Fig.2 ISSR map of pitaya DNA by using primer USC813, USC815 and USC853

表4 火龍果的DNA甲基化比率

由表4可見，作為EMS誘變的產(chǎn)物，與野生型相比，D具有較高的DNA甲基化比率，而R的甲基化比率略低于二者。同時，供試材料的DNA序列中，CCGG位點(diǎn)上的甲基化大多發(fā)生在外部的胞嘧啶上，這也符合自然界中外部胞嘧啶甲基化程度遠(yuǎn)大于內(nèi)部胞嘧啶的規(guī)律。

3 結(jié)論與討論

植物激素影響植物的株高，其中GA3是影響株高的最重要激素之一。GA3影響的矮化分為GA3缺陷型和GA3不敏感型。GA3缺陷型的特點(diǎn)是GA3生物合成途徑被抑制或阻斷，使植物體GA3缺乏或痕量存在，體外施用GA3后，突變體的矮化表型可恢復(fù)到野生型表型；而GA3不敏感型的特點(diǎn)則是植物體內(nèi)的GA3感受、利用途徑受阻，這類突變體植株往往GA3含量正常甚至相比WT偏高，而體外施加GA3也不會導(dǎo)致株高的恢復(fù)[8-10]。本試驗(yàn)D的GA3含量極顯著低于WT，而在施加GA3培養(yǎng)一定時間后，D的株高基本恢復(fù)到WT的水平，因此D為GA3缺陷型的矮化。

矮化突變體D是通過EMS誘變產(chǎn)生，大多數(shù)情況下，EMS誘變產(chǎn)生的突變大體為甲基化水平的表觀遺傳學(xué)變異[11-13]。近年來越來越多的研究表明，EMS誘變是一種高效的誘變手段，水稻、玉米、小豆等多種作物均通過EMS誘變開發(fā)出一系列的新品種[14-15]。本試驗(yàn)的ISSR分子標(biāo)記顯示D與WT的數(shù)個位點(diǎn)差異，這些位點(diǎn)差異可能是EMS誘變及組培環(huán)境的共同作用。當(dāng)然，D也顯示出較高CCGG位點(diǎn)的甲基化比率，這與EMS誘變的特征相符合，而D在株高水平上的突變和回復(fù)是受到DNA水平還是表觀遺傳學(xué)水平的影響，甚至是這二者的共同作用，只能通過后續(xù)對差異位點(diǎn)的測序定位才能得知。

形態(tài)學(xué)測定表明，R是D在株高水平上的回復(fù)突變，而R和D均伴隨WT不具備的刺座突變。施加GA3并未對D的刺座產(chǎn)生影響，因此D的刺座突變與其矮化突變并無直接關(guān)聯(lián)，很可能D是這2種突變同時發(fā)生并共存的突變體，而刺座突變的機(jī)理尚需進(jìn)一步探討。R在株高略低于WT的同時，卻有更高的GA3含量及更低的甲基化比率，這可能意味著R在對株高進(jìn)行回復(fù)的同時，也產(chǎn)生了一系列類似于GA3敏感型的變異。

[1] 鄧仁菊,范建新,蔡永強(qiáng),等.國內(nèi)外火龍果研究進(jìn)展及產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(6):188-192.

[2] 呂慶芳,李潤唐,鄒恒歡,等.火龍果和霸王花授粉效應(yīng)[J].中國南方果樹,2011,40(3):60-62.

[3] 范建新,鄧仁菊,李金強(qiáng).果樹誘變育種研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(22):9155-9157.

[4] 鄧仁菊,范建新,蔡永強(qiáng).60Co^γ射線輻照和EMS處理對火龍果成活率及幼苗生長的影響[J].激光生物學(xué)報,2011(1):22-26,31.

[5] 張冰雪,丁文鵬.EMS對火龍果種子萌發(fā)的影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報,2013,32(3):194-197.

[6] 洪 柳,鄧秀新.應(yīng)用MSAP技術(shù)對臍橙品種進(jìn)行DNA甲基化分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(11):2301-2307.

[7] 呂曉婷,趙春梅,王愛華,等.蘋果MSAP技術(shù)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(22):287-292.

[8] 張國華,張艷潔,叢日晨,等.赤霉素作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報,2009,29(2):0412-0419.

[9] 黃先忠,蔣才富,廖立力,等.赤霉素作用機(jī)理的分子基礎(chǔ)與調(diào)控模式研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報,2006,23(5):499-510.

[10] 王月華,韓烈保,曾會明,等.植物赤霉素矮化突變體研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2006,26(8):22-27.

[11] Mohamed Z, Wei-Seng H, Shek-Ling P, et al. EMS-induced mutagenesis and DNA polymorphism assessment through ISSR markers in Neolamarckia cadamba(kelampayan) and Leucaena leucocephala (petai belalang)[J]. European Journal of Experimental Biology, 2014,4(4): 156-163.

[12] Kim Y, Schumaker K S, Zhu J K. EMS mutagenesis of Arabiodopsis[J].Methods Mol Biol,2006,323:101-103.

[13] Motilal B, Jogeswar P, Ramya R M, et al. Analysis of EMS induced in vitro mutants of Asteracantha longifolia(L.) Nees using RAPD markers[J].Indian Journal of Biotechnology,2012(11):39-47.

[14] Kim Y, Schumaker K S, Zhu J K. EMS mutagenesis of Arabidopsis[J].Methods Mol Biol,2006,323:101-103.

[15] 張明義,王 翔,張彥芹,等.玉米EMS誘變材料的抗旱性篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(2):99-102.

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Genetic Analysis of Dwarf Mutant of Pitaya

CHEN Nan1， WEN Xiaopeng1*， CAI Yongqiang2， LIU Tao2， BAO Jiuling1

(1.InstituteofAgro-bioengineering,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025; 2.GuizhouInstituteofFruitTreeScience,Guiyang,Guizhou550006,China)

The genetic analysis of the dwarf mutant (D) and its reverse variation type(R)of Pitaya was carried out by ISSR markers, DNA methylation, as well as gibberellin (GA3) detection to provide new information of mutational mechanism of pitaya.Results:Compared with the wild type (WT), D and R demonstrated variations in thorny location, and both of them were sensitive to GA3, suggesting that D was a GA3-deficient dwarf mutant. Four polymorphic bands generated from three selected primers were score between D and WT.However, no aberrant markers were obtained between R and WT. The ratio of DNA methylation of D was 2.8% higher than that of WT, conversely, that of R was 0.9% lower than WT.

pitaya; dwarf mutant; ISSR marker; DNA methylation; GA3-deficient

2015-03-18； 2015-05-01修回

貴州省重大專項(xiàng)子項(xiàng)目“火龍果優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新及工廠化育苗技術(shù)研究”(20126006-1)

陳 楠(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：植物學(xué)研究。E-mail:sznjsz0430@qq.com

*通訊作者：文曉鵬(1965-)，男，教授，博士，從事植物cDNA文庫的構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因梨的基因表達(dá)等研究工作。 E-mail:xpwensc@hotmail.com

1001-3601(2015)05-0262-0163-03

S663.9

A

園藝·中藥材

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