吳瓏韜， 曹涵文， 潘建東， 甘乾福， 石沈炳， 梁學(xué)武*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2.福建省建陽市吉翔牧業(yè)有限公司， 福建 福州 354200)

?

荷斯坦奶牛HSP70-1基因多態(tài)性與熱應(yīng)激的關(guān)聯(lián)性

吳瓏韜1， 曹涵文1， 潘建東2， 甘乾福1， 石沈炳2， 梁學(xué)武1*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2.福建省建陽市吉翔牧業(yè)有限公司， 福建 福州 354200)

為我國南方荷斯坦奶?？篃釕?yīng)激品種的選育提供理論依據(jù)，使用PCR-SSCP方法，對327頭荷斯坦奶牛HSP70-1基因編碼區(qū)進行單核苷酸多態(tài)性檢測，并分析其與熱應(yīng)激的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：HSP70-1基因在1112位點發(fā)生C→A突變，有CC、CA和AA基因型，其中CA型個體血清三碘甲腺原氨酸(T3)顯著低于其他基因型個體(P<0.05)，甲狀腺素(T4)顯著低于AA型個體(P<0.05)，直腸溫度顯著低于CC型個體(P<0.05)；在3390位點發(fā)生T→C突變，有TT、TC和CC基因型。1112位點的皮質(zhì)醇(Cor)及3390位點各指標(biāo)基因型間差異均不顯著(P>0.05)。CA型個體對抗熱應(yīng)激的能力更強，1112多態(tài)位點可以作為提高奶?？篃釕?yīng)激能力的一個潛在遺傳標(biāo)記。

熱應(yīng)激蛋白70； 單鏈構(gòu)象多態(tài)性； 血生化； 直腸溫度

夏季高溫高濕氣候條件是制約我國南方奶牛業(yè)發(fā)展的一個重要因素。由于高產(chǎn)奶牛代謝旺盛，并且皮膚汗腺不發(fā)達，當(dāng)處于熱應(yīng)激時奶牛直腸溫度上升、脈搏及呼吸頻率加快[1]；采食量下降，使機體營養(yǎng)攝入量減少，內(nèi)分泌機能紊亂，導(dǎo)致產(chǎn)奶量明顯降低，并且牛奶中乳脂率、乳糖率、乳蛋白率也會下降，嚴(yán)重的熱應(yīng)激會引起奶牛休克、死亡[2]；熱應(yīng)激會降低公牛的精子活力，對受精率也有很大影響[3]。因此，選育抗熱應(yīng)激能力強的奶牛品種對于發(fā)展南方奶牛業(yè)具有重要意義。

熱應(yīng)激蛋白70(HSP70)是一種分子伴侶蛋白，在奶牛發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)時起重要的保護作用。在不良環(huán)境因素的影響下，HSP70能夠保護機體，使動物適應(yīng)環(huán)境的變化。HSP70能增強機體的熱耐受能力、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在提高抗氧化能力、免疫應(yīng)答等方面也有重要作用[4]，HSP70基因表達水平與熱應(yīng)激強度和持續(xù)的時間呈正比關(guān)系[5]。HSP70基因的多態(tài)性會影響熱應(yīng)激條件下影響血清超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)等的濃度[6]。目前，南方夏季高溫高濕氣候條件給奶牛業(yè)生產(chǎn)造成的影響研究集中于合理建造、改造牛舍，改善日糧以及生理代謝分析等方面，對于奶牛個體基因差異以及適應(yīng)力的研究較少[7]。為此，筆者于2014年7月使用PCR-SSCP方法，對327頭荷斯坦奶牛HSP70-1基因進行多態(tài)性檢測，分析了HSP70-1基因多態(tài)性與血液生化指標(biāo)及奶牛直腸溫度的關(guān)聯(lián)性，為我國南方荷斯坦奶?？篃釕?yīng)激品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

動物：荷斯坦奶牛327頭，胎次1～6胎，均來自福建省建陽市吉翔牧業(yè)。試劑：Taq PCR Mastermix、血液基因組DNA提取試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；血液三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)試劑盒，均購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增

于2014年7月10—11日尾靜脈采血10 mL，使用 ACD抗凝劑保存于-20℃冰箱。用DNA提取試劑盒提取DNA。根據(jù)NCBI登錄(登錄號：AY 149619.1)的荷斯坦奶牛HSP70-1基因設(shè)計2對引物(表1)，由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Taq PCR Mastermix 10 μL，H2O 8 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，57℃和61℃退火30 s，72℃延伸35 s，38個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物保存于4℃冰箱。

表1 荷斯坦奶牛HSP70-1基因的PCR引物

1.3 PCR產(chǎn)物檢測及測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷目的條帶是否清晰。取PCR產(chǎn)物3 μL與變性上樣緩沖液8 μL混合，98℃變性10 min，立即置于冰上放入-20℃冰箱中冷卻10 min，上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件為90V、時間13 h，銀染顯色。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，判斷是否具有特異性目的條帶。發(fā)現(xiàn)有特異性條帶的樣品，由上海生工生物科技有限公司進行測序，使用BLAST軟件進行序列比對。

1.4 直腸溫度及血清指標(biāo)含量測定

于7月8—11日連續(xù)4天14:00左右使用獸用體溫計測定奶牛直腸溫度，同時在牛舍8個位置離地面2 m處放置干濕溫度計，分別測定牛舍溫濕度，計算平均值和溫濕指數(shù)(THI)。

THI=0.72(T1+T2)+40.6

式中，T1、T2分別表示干濕溫度計上干、濕球度數(shù)。血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、皮質(zhì)醇(Cor)按試劑盒說明書測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用軟件Excel統(tǒng)計基因頻率和基因型頻率，對等位基因的哈代-溫伯格平衡性進行卡方檢驗。對基因型效應(yīng)分析建立一般線性模型：

Yijm=μ+Ti+Gj+eijm

式中，Yijm表示個體表型記錄，Ti為胎次效應(yīng)，Gj為標(biāo)記基因型效應(yīng)，eijm為隨機誤差。使用軟件SPSS 20進行HSP70-1多態(tài)位點基因型與血清生化指標(biāo)、直腸溫度的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛舍溫濕指數(shù)

經(jīng)測定，7月8—11日的平均氣溫分別為34.3℃、33.7℃、36.1℃和35.7℃，溫濕指數(shù)(THI)分別為86.25、86.32、88.26和86.68。Fuquary J W等[8]研究表明，當(dāng)7290時奶牛處于嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激。由此表明，試驗?zāi)膛Ｌ幱谥卸葻釕?yīng)激狀態(tài)。

2.2 PCR產(chǎn)物及多態(tài)性

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖電泳，分別在247 bp和216 bp位置出現(xiàn)清晰條帶(圖1)。根據(jù)銀染結(jié)果和測序結(jié)果判斷，引物P1產(chǎn)物在1112位點存在C→A突變，形成CC、CA和AA基因型(圖2～4)，基因型頻率分別為66.9%、28%和5.1%，C為優(yōu)勢等位基因(表2)；引物P2產(chǎn)物在3390位點存在T→C突變，形成TT、TC和CC基因型(圖2～4)，基因頻率分別為63.7%、30.8%和5.5%，T為優(yōu)勢等位基因(表2)。從表3看出，1112和3390突變位點的多態(tài)信息含量分別為0.261 3和0.251 9，均屬于中度多態(tài)。經(jīng)卡方檢驗，2個多態(tài)位點均符合Hardy-Weinberg平衡。

注：M為100 bp Ladder DNA marker，1～10為擴增產(chǎn)物。

Note: M, 100 bp DNA marker; 1～10, amplification products.

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖2 P1和P2擴增片段聚丙烯酰胺電泳凝膠銀染圖譜

圖3 P1 PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果(從上至下分別是CC、CA和AA型)

圖4 P2 PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果(從上至下分別是TT、TC和CC型)

表2 荷斯坦奶牛1112和3390位點的基因頻率和基因型頻率

表3 基因座位點的群體遺傳特征

表4 突變位點與血清生化指標(biāo)濃度和直腸溫度的關(guān)聯(lián)性

注：同位點同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters in the same column indicate significance of difference at 0.05 level.

2.3HSP70-1基因多態(tài)位點與血清生化指標(biāo)和直腸溫度的關(guān)聯(lián)性

從表4看出，1112多態(tài)位點與血清T3濃度、T4濃度及直腸溫度存在顯著相關(guān)，并且CA型個體的血清T3含量顯著低于CC型和AA型，血清T4含量顯著低于AA型，CC型和CA型個體的直腸溫度均顯著低于AA型，皮質(zhì)醇各基因型間差異均不顯著。3390多態(tài)位點與所測項目無顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

3.1HSP70-1基因多態(tài)性對奶牛熱應(yīng)激血清參素的影響

甲狀腺分泌的T3、T4可以提高基礎(chǔ)代謝，增加產(chǎn)熱，促進蛋白質(zhì)合成，且T3比T4具有更強的生物活性。奶牛處于熱應(yīng)激時，甲狀腺代謝能力下降，T3、T4分泌量降低以減少自身產(chǎn)熱來對抗熱應(yīng)激對機體的損害[9]；在熱應(yīng)激狀態(tài)下，不同泌乳階段奶牛血清的T3、T4濃度均低于非熱應(yīng)激期[10]。陳強等[11]研究表明，奶牛HSP70基因作為抗熱應(yīng)激選育的分子標(biāo)記不太理想，這可能與其樣本量小有關(guān)。研究結(jié)果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位點的CA型個體血清T3濃度低于其他型個體，并且直腸溫度低于CC型和顯著低于AA型個體(P<0.05)，表明CA型個體對抗熱應(yīng)激的能力更強，1112多態(tài)位點可以作為提高奶?？篃釕?yīng)激能力的一個潛在遺傳標(biāo)記，但還需要擴大樣本和檢測HSP70蛋白表達水平來進一步驗證。

皮質(zhì)醇是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類激素，可以促進糖、脂肪和蛋白質(zhì)分解，使血糖濃度增加[12]。目前，關(guān)于皮質(zhì)醇在熱應(yīng)激時期的變化報道不一，一般認為，急性熱應(yīng)激會使血清皮質(zhì)醇升高，慢性熱應(yīng)激時下降。荷斯坦奶牛HSP70-1基因2個多態(tài)位點血清皮質(zhì)醇濃度CC、TC基因型個體最低，但與其他基因型個體間差異均不顯著。

3.2HSP70-1基因多態(tài)性對直腸溫度的影響

直腸溫度是判斷奶牛是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)，奶牛直腸溫度遺傳力在0.25～0.65，在熱應(yīng)激狀態(tài)下直腸溫度較低的奶牛具有更強的抗熱應(yīng)激能力[13]。李建國[14]等認為，可以將奶牛直腸溫度作為判斷是否處于熱應(yīng)激的依據(jù)。研究結(jié)果表明，荷斯坦奶牛HSP70-1基因1112位點CA型個體直腸溫度顯著低于其他基因型個體，說明CA型個體在夏季高溫時具有更強的抗熱應(yīng)激能力。

[1] 魏學(xué)良，張家驊，王豪舉，等.高溫環(huán)境對奶牛生理活動及生產(chǎn)性能的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005(5):13-15.

[2] Srikandakumar A，Johnson E H.Effect of heat stress on milk production，rectal temperature，respiratory rate and blood chemistry in Holstein，Jersey and Australian Milking Zebu cows[J].Tropical animal health and production，2004，36(7):685-692.

[3] Baler R，Dahl G，Voellmy R.Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization，modification，and rapid translocation of heat shock transcription factor HSF1[J].Molecular and cellular biology，1993，13(4):2486-2496.

[4] Cowing D W，Bardwell J C，Craig E A，et al.Consensus sequence for Escherichia coli heat shock gene promoters[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences，1985，82(9):2679-2683.

[5] 劉慶華，梁學(xué)武.娟姍和荷斯坦奶牛HSPA1A基因SSCP多態(tài)性與耐熱性能的相關(guān)分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006(4):321-324.

[6] 劉慶華，于軍方，梁學(xué)武，等.奶牛HSP基因多態(tài)性與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009(2):160-165.

[7] Collier R J，Collier J L，Rhoads R P，et al.Review:Genes involved in the bovine heat stress response[J].Dairy Sci，2008，91(2)：445-454.

[8] Fuquary J W.Heat stress as it affects animal production[J].J Anim Sci，1981，2(1):164-174.

[9] Cross W B，Siegel P B.Effect of social stress and steroids on antibody production[J].Avian Disease，1973，17(4):807-815.

[10] 宋代軍，何 欽，姚焰礎(chǔ).熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛生產(chǎn)性能和血清激素濃度的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2013(10):2294-2302.

[11] 陳 強，李忠浩，王根林.奶牛HSP70基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)系[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007(7):84-86.

[12] Snoj T，Kobal S，Majdic G.Effects of season age and breed on semen characteristics in different Bostaurus breeds in a 31-year retrospective study[J].Theriogenology，2013，79(5):847-852.

[13] Elvinger F，Natzke R P，Hansen P J.Interactions of heat stress and bovine somatotropin affecting physiology and immunology of lactating cows[J].Journal of dairy science，1992，75(2):449-462.

[14] 李建國，桑潤滋，張正珊，等.熱應(yīng)激對奶牛生理常值、血液生化指標(biāo)、繁殖及泌乳性能的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998(4)：69-70.

(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Relationship Between Heat Stress and Polymorphism ofHSP70-1 Gene in Holstein Cow

WU Longtao1, CAO Hanwen1, PAN Jiandong2, GAN Qianfu1, SHI Shenbing1, LIANG Xuewu1*

(1.CollegeofAnimalSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002; 2.JixiangAnimalHusbandryLimitedCompany,Fuzhou,Fujian354200,China)

The relationship between heat stress and polymorphism of HSP70-1 gene was studied by analyzing single nucleotide polymorphism in HSP70-1 coding sequence of Holstein cow by pcr-sscp to provide the theoretical basis for breeding of Holstein cow with resistance to heat stress in Southern China. Results:There is C→A mutation (CC, CA and AA genotypes) on 1112 locus of HSP70-1 gene. T3, T4and rectal temperature of the individuals with CA genotype are lower than other individuals with other genotypes, individuals with AA genotype and individuals with CC genotype significantly. There is T→C mutation (TT, TC and CC genotypes) on 3390 locus of HSP70-1 gene. There is no significant difference in Cor on 1112 locus and different indexes on 3390 locus between different genotypes. The 1112 polymorphism locus can be used as a potential genetic marker to improve resistance to heat stress of Holstein cow because individual with CA genotype has of strong resistance to heat stress.

heat stress protein 70; single-stranded conformation polymorphism (SSCP); blood biochemistry; rectal temperature

2014-12-30； 2015-02-28修回

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目“南方荷斯坦奶牛高產(chǎn)耐熱新品系建立與培育”(13C26213502913)；福建省科技計劃項目“南方荷斯坦奶牛高產(chǎn)耐熱新品系的繁育與示范 ”(2014S0069)

吳瓏韜(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail：wulongtao789@qq.com

*通訊作者：梁學(xué)武(1960-)，男，教授，從事反芻動物營養(yǎng)研究與生產(chǎn)工作。E-mail：faulxw2000@163.com

1001-3601(2015)05-0259-0153-04

S823

A

畜牧·獸醫(yī)·水產(chǎn)

Animal Husbandry·Veterinary·Fishery