李堆淑

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院， 陜西 商洛 726000)

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生防放線菌的酶學(xué)特性及其代謝產(chǎn)物

李堆淑

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院， 陜西 商洛 726000)

為獲得更多特異性各異的生防放線菌，采用皿內(nèi)瓊脂塊法和試管斜面劃線法，對(duì)從陜西省商洛市土壤分離的11株生防放線菌菌株(MX1，MX2，MX3，MX4，MX5，MX6，MX7，MX8，MX9，SY1，SY2)和供試細(xì)黃鏈霉菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。結(jié)果表明：有8株菌株產(chǎn)脂肪酶，SY1、MX1和細(xì)黃鏈霉菌的渾濁圈很明顯，直徑大于15 mm的菌株共計(jì)4株；有10株菌株產(chǎn)生卵磷脂酶，直徑大于15 mm的菌株共計(jì)5株；有11株菌株對(duì)淀粉的水力較強(qiáng)，直徑大于15 mm的共計(jì)6株；僅4株菌株可水解酪蛋白。12株供試菌株革蘭氏染色均呈陽性；V-P試驗(yàn)，MX1、MX2和SY1呈陽性，MX6呈弱陽性；甲基紅試驗(yàn)，MX2、MX3和細(xì)黃鏈霉菌呈陽性，MX9呈弱陽性；共有9株菌株可使明膠液化，占供試菌株的75%；僅SY2產(chǎn)纖維素酶，有3株菌株產(chǎn)過氧化氫酶；有2株菌株能使牛奶培養(yǎng)基凝固，4株菌株能使其胨化。

生防放線菌； 酶活性； 糖代謝； 商洛； 陜西

放線菌作為一類非常重要的生物物種，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能。放線菌普遍存在于土壤和廣泛分布在各種環(huán)境中，可產(chǎn)生特定的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)物具有新穎性、獨(dú)特性和多樣性。目前對(duì)生防放線菌的利用主要集中在抗生素方面。S-921是河北省微生物研究所分離的鏈霉菌(Streptomycesaureus)產(chǎn)生的抗生素，對(duì)蘋果樹腐爛病具有強(qiáng)烈的抑制作用[1]。張宇等[2]用放線菌A11菌株防治水稻稻瘟病效果顯著。宋永燕等[3]報(bào)道，吸水鏈霉菌對(duì)水稻稻瘟病菌的抑菌率達(dá)92.2%。彭杰等[4]研究表明，海綿共附生放線菌(Streptomycessp.)A01059抗稻瘟病的效果較強(qiáng)。韋榮編等[5]報(bào)道，放線菌Z0604對(duì)人類病原菌的抗菌能力很強(qiáng)，并且抗腫瘤能力強(qiáng)。劉睿等[6]研究表明，海綿共附生放線菌(Saccharopolysporasp. nov)抗腫瘤也有顯著成效。由于不同生態(tài)環(huán)境土壤中的生防放線菌種類與特性不同，也未見關(guān)于對(duì)陜西省商洛地區(qū)土壤中分離生防放線菌酶學(xué)特性及其代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道。對(duì)此，筆者從該地區(qū)土壤中分離生防放線菌，從溫度、pH、滲透壓、氮源和碳源的適應(yīng)性及代謝產(chǎn)物等方面研究分離菌的生理生化特征，以獲得特異性各異的生防放線菌，為其商品化生產(chǎn)應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細(xì)黃鏈霉菌，商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；MX1、MX2、MX3、MX4、MX5、MX6、MX7、MX8、MX9、SY1和SY2生防放線菌，從陜西省商洛市苜蓿(簡(jiǎn)稱MX)和三葉草(簡(jiǎn)稱SY)土壤中分離的11株生防放線菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)放線菌菌株培養(yǎng)基。改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基[7]：KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO40.5 g、淀粉20.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂18.0 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水1 000 mL，每300 mL培養(yǎng)基中加100 mg/kg的K2Cr2O71 mL。

2)生理生化特征測(cè)定的供試培養(yǎng)基和培養(yǎng)液。淀粉水解培養(yǎng)基[8]，明膠液化[9]培養(yǎng)基，卵黃瓊脂培養(yǎng)基[10]，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液[11]，吐溫80培養(yǎng)基，酪蛋白水解培養(yǎng)基[12]，不含碳源的合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液[13]。

1.2 脂肪、淀粉、酪蛋白及纖維素水解試驗(yàn)

1.2.1 脂肪水解(吐溫80) 參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，將待檢菌株點(diǎn)接到吐溫80培養(yǎng)基上，每皿3個(gè)相同菌株，25℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落周圍是否有渾濁圈產(chǎn)生(產(chǎn)脂肪酶的菌株會(huì)分解油脂產(chǎn)生渾濁圈)，根據(jù)渾濁圈出現(xiàn)的早晚和渾濁圈的大小選出脂肪酶活性高的菌株。

1.2.2 淀粉水解 參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行，將待檢菌接種于淀粉培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)7 d后在培養(yǎng)基表面加入碘液。如有淀粉酶產(chǎn)生，形成無色透明圈。

1.2.3 酪蛋白水解 參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，在酪蛋白水解培養(yǎng)基上點(diǎn)接放線菌菌株，25℃培養(yǎng)7 d后觀察。根據(jù)菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈的早晚和大小反應(yīng)該菌水解蛋白質(zhì)能力的強(qiáng)弱。若菌落周圍無透明圈出現(xiàn)則該菌株不能水解蛋白質(zhì)。

1.2.4 纖維素水解 參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行，配制適合放線菌生長(zhǎng)而不含碳源的合成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分裝試管后，以新華一號(hào)濾紙作纖維素(碳源)，把其切成寬1 cm、長(zhǎng)8 cm濾紙條，加入試管中，一半浸在液內(nèi)，一半露在液外，將鑒定菌株接種在液外一段濾紙條上，于25℃培養(yǎng)30 d后觀察。若該菌能將濾紙條分解成一團(tuán)松散的纖維，或使之折斷，碎裂成質(zhì)狀者為陽性，說明該菌株產(chǎn)生纖維素酶使之水解。反之，濾紙無變化者為陰性。

1.3 卵磷脂酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行，將被檢菌點(diǎn)接于1%的卵黃瓊脂平板上，于25℃培養(yǎng)5～7 d，若在菌落周圍產(chǎn)生渾濁圈即為陽性，否則，為陰性。渾濁圈的大小和菌落出現(xiàn)的早晚可反應(yīng)菌株卵磷脂酶的活性強(qiáng)弱。

1.4 牛奶凝固與胨化測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行，將牛奶10 000 r/min離心，去上層油脂成脫脂牛奶。將待測(cè)定菌株接種于脫脂牛奶中，25℃培養(yǎng)，分別在3 d、6 d、10 d、20 d和30 d各觀察1次，若牛奶出現(xiàn)凝固即為凝固；若牛奶變得清亮而透明則為胨化。

1.5 生理生化試驗(yàn)

1.5.1 V-P 參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，將待測(cè)菌接種到配制好并滅菌過的葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液中，26℃培養(yǎng)7 d，根據(jù)培養(yǎng)液的多少適量先加入3 mLα-萘酚，再加入40%氫氧化鈉溶液1.2 mL并充分振蕩，以使空氣中的氧融入，放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫25 min觀察，若培養(yǎng)液呈紅色，則為陽性反應(yīng)，無色則為陰性反應(yīng)，粉紅色則為弱陽性反應(yīng)。

1.5.2 甲基紅 參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，將待測(cè)菌接種到葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液中，26℃培養(yǎng)7 d，后滴入甲基紅試劑5～6滴，培養(yǎng)液立刻呈紫色的為陽性反應(yīng)，呈黃色的陰性反應(yīng)，橘黃色為弱陰性反應(yīng)。

1.5.3 革蘭氏染色 參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，涂片固定，草酸胺結(jié)晶紫染，水洗，番紅染色液復(fù)染，干燥，鏡檢。陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色。

1.5.4 明膠液化 參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行，將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，深度約為2/3，于25℃培養(yǎng)7 d，逐日觀察結(jié)果。在觀察結(jié)果前，先置于4℃冰箱內(nèi)30 min，再看結(jié)果，如培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性。

1.6 耐鹽度及最適pH試驗(yàn)

1.6.1 耐鹽度 配制200 mL不含NaCl的高氏一號(hào)培養(yǎng)基分裝36支試管，每支5 mL，其中12支不含NaCl，12支NaCl濃度5%，12支NaCl濃度10%，滅菌后劃線接種，25℃培養(yǎng)5～7 d觀察菌株出現(xiàn)的早晚和生長(zhǎng)情況來判斷菌株的耐鹽性。

1.6.2 最適pH 參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，配制500 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基，每取100 mL用廣泛試紙調(diào)pH分別為7、8、9、10和11。將待測(cè)菌單劃線分別接種到不同pH培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5～7 d后觀察菌株出現(xiàn)的早晚和生長(zhǎng)情況，以判斷菌株的耐堿性。

1.7 過氧化氫酶試驗(yàn)

用滴管滴1滴30%的過氧化氫于載玻片上，然后用接種環(huán)挑取少許菌株，將待測(cè)菌均勻涂在載玻片上，若出現(xiàn)氣泡，則該菌有過氧化氫酶，否則，該菌沒有過氧化氫酶。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS17.0單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的酶學(xué)特性及糖代謝方式

從表1可見，有8株菌株產(chǎn)脂肪酶，其中，SY1、MX1和細(xì)黃鏈霉菌的渾濁圈很明顯，說明這3株菌株的脂肪酶活性較強(qiáng)，SY1脂肪酶水解圈直徑最大，達(dá)22.00 mm；直徑大于15 mm的菌株共計(jì)4株，占供試菌的33.3%。有10株菌株產(chǎn)生卵磷脂酶，其中，MX9卵磷脂水解圈直徑最大，為(19.00±1.414) mm，直徑大于15 mm的菌株共計(jì)5株，占供試菌株的41.6%。11株菌株對(duì)淀粉的水解力較強(qiáng)，其中，SY1淀粉水解圈直徑最大，為(34.00±1.414) mm；直徑大于15 mm的共計(jì)6株，占供試菌株的50%。供試菌酪蛋白水解能力較差，僅有4株菌株可水解酪蛋白，占所有供試菌株的33.3%，MX9酪蛋白水解圈直徑最大，為(18.50±0.707) mm。

表1 不同菌株的水解能力

從表2可知，12株供試菌株革蘭氏染色均呈陽性；V-P試驗(yàn)，MX1、MX2和SY1呈陽性，MX6呈弱陽性，說明這4株菌株的糖代謝是葡萄糖分解成丙酮酸，丙酮酸脫羧后成乙酰甲基甲醇。MX2、MX3和細(xì)黃鏈霉菌甲基紅試驗(yàn)呈陽性，MX9呈弱陽性，說明這4株菌株的糖代謝是葡萄糖分解為丙酮酸，丙酮酸再分解為甲酸、乙酸和乳酸等。共有9株菌株可明膠液化，占供試菌株的75%，說明大部分菌株產(chǎn)明膠酶且酶活性較強(qiáng)。只有SY2菌株產(chǎn)纖維素酶，有3株菌株產(chǎn)過氧化氫酶。能使牛奶培養(yǎng)基凝固的菌株有2株，使其胨化的菌株有4株。

表2 不同菌株的酶學(xué)特性及糖代謝

注：+表示陽性反應(yīng)；+-表示弱陽性；-表示陰性反應(yīng)。

Note: +, positive reaction; +-, weakly positive; -, negative reaction.

2.2 菌株對(duì)pH和滲透壓的適應(yīng)性

通過試驗(yàn)觀察，pH 7時(shí)，各菌株菌落生長(zhǎng)的快慢依次為MX9>SY2>MX3>MX2>MX1>MX6>細(xì)黃鏈霉菌>MX8>SY1>MX5>MX7>MX4；pH 8時(shí)，各菌株菌落生長(zhǎng)的快慢依次為MX7>MX1>MX9>細(xì)黃鏈霉菌>SY2>MX8>SY1>MX6>MX3>MX5>MX4>MX7；pH 9時(shí)，各菌株菌落生長(zhǎng)的快慢依次為MX2>MX1>細(xì)黃鏈霉菌>SY1>MX9>SY2>MX8>MX4>MX6>MX3>MX7>MX5;pH10時(shí)，各菌株菌落生長(zhǎng)的快慢依次為MX2>細(xì)黃鏈霉菌>MX1>SY1>MX8>SY2>MX3>MX9>MX5>MX7>MX6>MX4；pH 11時(shí)，各菌株菌落生長(zhǎng)的快慢依次為SY1>MX1>MX2>SY2>MX9>MX6>細(xì)黃鏈霉菌>MX8>MX5>MX7>MX3>MX7。

從表3可知，在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，12株菌株在NaCl溶液濃度為0～5%的培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)均較好，說明12株菌株耐鹽性較強(qiáng)。且在培養(yǎng)過程中MX7菌株生長(zhǎng)速度最快，總是最先形成菌落，表明MX7菌株的耐堿性極強(qiáng)，但pH 11時(shí)，MX7長(zhǎng)勢(shì)最好。培養(yǎng)基的耐鹽度為10%時(shí)，只有MX3和MX5菌株的長(zhǎng)勢(shì)較好，最適pH為9。

表3 菌株耐鹽度及其最適pH值

Table 3 Salt tolerance and optimum pH value of different strains

菌株StrainsNaCl的耐受度/%Salttolerance0510最適pHOptimumpHvalueMX1++-11MX2++-7MX3+++9MX4++-7MX5+++9MX6++-7MX7++-11MX8++-7MX9++-7SY1++-11SY2++-7細(xì)黃鏈霉菌++-10 Streptomycesmicroflavus

注：+表示生長(zhǎng)良好，-表示生長(zhǎng)較差。

Note: +, good growth; -, poor growth.

3 結(jié)論與討論

1) 研究結(jié)果表明，12株菌株的菌落光平且均為白色，基內(nèi)菌絲顏色呈紫紅色、檸檬黃和無色等，顏色不盡相同。參考《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[15]得知，這11株生防放線菌菌株均屬于鏈霉菌的白孢類群放線菌。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，MX1和MX7均含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶和明膠酶；MX2均含卵磷脂酶和淀粉酶；MX3、MX9和細(xì)黃鏈霉素均含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、酪蛋白酶和明膠酶；MX4和MX5均含卵磷脂酶、淀粉酶和明膠酶；MX6含淀粉酶和明膠酶；MX8含脂肪酶、卵磷脂酶和過氧化氫酶；SY1含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、酪蛋白酶、明膠酶和過氧化氫酶；SY2含卵磷脂酶、淀粉酶、明膠酶、纖維素酶和過氧化氫酶?？梢?，從三葉草土壤中分離的SY1產(chǎn)酶最多，說明SY1菌株的代謝產(chǎn)物較多。11株生防放線菌菌株的形態(tài)特征和生理生化特征與細(xì)黃鏈霉菌不同。說明，從苜蓿和三葉草土壤中分離的11株生防放線菌可能是不同的白孢類群鏈霉菌。

2) 趙淑莉[16]從吉林省人參地、洮南和長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)土樣中篩選的BZ45菌株pH耐受范圍是5.0～12.0，最佳的pH是7.0或8.0，明膠能液化，牛奶不但能凝固還能胨化，能產(chǎn)生脂肪酶，而淀粉不能水解，即無淀粉酶產(chǎn)生，有纖維素酶產(chǎn)生，能分解纖維素，耐鹽范圍為0.1%～5%。本研究從陜西省商洛市土樣分離的11株生防放線菌菌株和細(xì)黃鏈霉菌均與BZ45菌株不同。本研究中12株供試菌株pH耐受范圍均大于7.0，耐鹽范圍為0～5%。其中，有11株菌株可產(chǎn)生淀粉酶，8株菌株可產(chǎn)生脂肪酶，1株菌株可產(chǎn)生纖維素酶，2株菌株既能使牛奶凝固又能使其胨化，有9株菌株可使明膠液化。余佳清等[17]從江西井岡山自然保護(hù)區(qū)發(fā)病毛竹中分離到1株生防放線菌菌株FXj9，該菌株可使纖維素和淀粉水解，使明膠液化，使牛奶凝固不能使其胨化，能還原硝酸鹽。本研究的12株供試菌株的生化反應(yīng)與菌株FXj9不同。說明，不同生境條件及不同植被根際分布生防放線菌的特異性存在差異。

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(責(zé)任編輯： 楊 林)

Enzymatic Characteristics and Metabolites of Biocontrol Actinomycetes

LI Duishu

(CollegeofBiomedicineandFoodEngineering,ShangluoUniversity,Shangluo,Shaanxi726000,China)

The biophysical and biochemical test of 11 actinomycetes strains(MX1，MX2，MX3，MX4，MX5，MX6，MX7，MX8，MX9，SY1 and SY2)isolated from soil of Shangluo City in Shaanxi and testedStreptomycesmicroflavuswas conducted by the agar block and test-tube slant streak plate methods to obtain more biocontrol actinomycetes with different specificities. Results:The diameter of hydrolyzation circle of 4 strains from 8 strains with producing lipase is more than 15 mm, and SY1, MX1 andStreptomycesmicroflavusstrains have obvious hydrolyzation circles. The diameter of hydrolyzation circle of 5 strains from 10 strains with producing lecithinase is more than 15 mm. The diameter of hydrolyzation circle of 6 strains from 11 strains with strong starch hydrolysis capacity is more than 15 mm. 4 strains can hydrolyze casein. 12 tested strains present positive in gram stain test. MX1, MX2 and SY1 strains present positive and MX6 strain presents weakly positive in V-P test. MX2, MX3 andStreptomycesmicroflavusstrains present positive and MX9 strain presents weakly positive in methyl red test. 9 strains are of gelatin liquefaction capacity. Only SY2 strain can produce cellulose. 3 strains can produce catalase. 2 strains have the capacity of solidifying milk medium and 4 strains have the capacity of peptonizing milk.

biocontrol actinomycetes; enzymatic activity; glycometabolism; Shangluo; Shaanxi

2014-09-18； 2015-04-21修回

陜西省教育廳科學(xué)研究專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目“生防放線菌誘導(dǎo)商洛黃芩抗根腐病及促生性研究”(2013JK0737)；商洛學(xué)院科研基金項(xiàng)目“生防放線菌多樣性及其對(duì)黃芩根腐病防效研究”(13SKY-FWDF002)

李堆淑(1977-)，女，副教授，碩士，從事植物病理學(xué)及微生物學(xué)研究。E-mail:lds1202@163.com

1001-3601(2015)05-0258-0149-04

S154.38+3

A