趙聯(lián)正， 謝占玲，2*， 賈賢卿

(1.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

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鐮刀菌Q7-31T菌株植物細(xì)胞壁降解酶系的結(jié)構(gòu)

趙聯(lián)正1， 謝占玲1，2*， 賈賢卿1

(1.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016)

為探究植物細(xì)胞壁降解酶高效降解細(xì)胞壁的機(jī)制，用RT-PCR方法對(duì)Q7-31T菌株植物細(xì)胞壁降解酶基因片段進(jìn)行克隆，使用Prot-Param、SOPMA、ProtScale Server等軟件對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)分析。結(jié)果表明：將Q7-31T菌株植物細(xì)胞壁降解相關(guān)酶歸為GH5家族內(nèi)切葡聚糖酶、GH7家族內(nèi)切葡聚糖酶、GH7家族外切葡聚糖酶和GH10家族內(nèi)切木聚糖酶4類酶。這些相關(guān)酶類為中等分子量大小，二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種元件構(gòu)成，其中無(wú)規(guī)則卷曲的數(shù)量最高；均為親水性酶，磷酸化位點(diǎn)比例較高，存在1～2個(gè)糖基化位點(diǎn)；均存在較高比例的催化結(jié)構(gòu)域，三級(jí)結(jié)構(gòu)呈中空的C字形。結(jié)論：少量的糖基化位點(diǎn)、高比例的催化結(jié)構(gòu)域、多變的三維構(gòu)象、大量的磷酸化位點(diǎn)與高效的協(xié)同作用方式可能決定Q7-31T菌株的植物細(xì)胞壁降解酶對(duì)細(xì)胞壁的高效降解。

鐮刀菌； 植物細(xì)胞壁降解酶； 結(jié)構(gòu)

纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，目前分布最廣的天然碳水化合物是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，占植物干重的35%～50%，也是地球生物圈碳素和能量循環(huán)的主要部分。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又被木質(zhì)素、半纖維素層包圍，將其水解成可利用的葡萄糖難度大，到目前為止，仍未得到較好地利用[1-2]。隨著世界人口驟長(zhǎng)，為解決日益加劇的食品和能源危機(jī)，纖維素資源的利用引起世界各國(guó)極大關(guān)注和高度重視。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基因工程等一系列分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使這一領(lǐng)域的研究不斷深入，其中，纖維素降解機(jī)理和植物細(xì)胞壁降解酶成為其研究的主要組成部分[3-4]。

纖維素酶使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的詳細(xì)機(jī)理研究尚未有定論，許多學(xué)者對(duì)于各個(gè)組分的作用機(jī)理提出不同的觀點(diǎn)，如協(xié)同作用模型、Cl-CX假說(shuō)、競(jìng)爭(zhēng)吸收模型等[5-6]。目前，通過(guò)基因工程技術(shù)并利用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)改造以及表達(dá)纖維素降解相關(guān)酶基因已取得一定的進(jìn)展，但對(duì)于纖維素酶將纖維素降解成為葡萄糖的詳細(xì)機(jī)制研究尚未定論。并且，依然存在纖維素酶的單位產(chǎn)量較低、胞內(nèi)酶提取困難、提取工藝繁雜、生產(chǎn)成本居高不下等關(guān)鍵問(wèn)題。纖維素降解機(jī)理的研究有助于從根本上突破纖維素酶產(chǎn)量低、工業(yè)化生產(chǎn)難實(shí)現(xiàn)的瓶頸。筆者擬以鐮刀菌屬Q(mào)7-31T菌株的植物細(xì)胞壁降解酶系為研究對(duì)象，分析其酶系的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為進(jìn)一步探究植物細(xì)胞壁降解酶高效降解細(xì)胞壁的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鐮刀菌(Fusariumsp. )Q7-31T菌株，由青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室于2007年從青海省大通縣寶庫(kù)鄉(xiāng)采集的羊肚菌子實(shí)體上自行分離純化獲得，保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(登錄號(hào)為CGMCC 3.17610)，實(shí)驗(yàn)室中使用固體活化培養(yǎng)基于室溫保存。

1.1.2 酶及試劑盒 DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等基因擴(kuò)增試劑全部購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，DL2000 DNA Marker、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基粉末39 g，1 000 mL水，121℃滅菌20 min；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，Mendels營(yíng)養(yǎng)鹽，121℃高壓滅菌20 min；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：燕麥秸稈粉0.3%，蛋白胨0.3%，Mendels營(yíng)養(yǎng)鹽，121℃高壓滅菌20 min；Mendels營(yíng)養(yǎng)鹽[7]：(NH4)2SO41.4 g/L、KH2PO42.0 g/L、尿素 0.3 g/L、CaCl20.3 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO45.0 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl22.0 mg/L。

1.2 RT-PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同一家族內(nèi)切葡聚糖酶系中近源菌種的基因，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索對(duì)應(yīng)的基因序列。應(yīng)用Clustalx 1.83軟件將獲得的基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到保守序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)多對(duì)引物(表1)，并用Oligo 6.0軟件對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行評(píng)估和分析。由上海生工生物工程有限公司合成引物。

1.3 RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模版，確定最佳RT-PCR反應(yīng)體系(表2)，總體系為25 μL。

1.4 鐮刀菌Q7-31T的總RNA提取

將Q7-31T菌種活化后，將其接種到液體種子培養(yǎng)基中，170 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)2 d。將其接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，170 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)。待其達(dá)到產(chǎn)植物細(xì)胞壁降解酶最旺盛時(shí)期，將菌液10 000 r/min，4℃離心5 min，收集菌絲，作為材料進(jìn)行總RNA的提取。總RNA的提取采用真菌總RNA提取試劑盒，參照使用說(shuō)明提取Q7-31T菌株的總RNA。用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，電泳檢測(cè)RNA條帶，并將其稀釋至50 ng/μL，-20℃保存。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 Primer sequence of RT-PCR amplification

引物編號(hào)PrimerNo.Primer名稱Primername引物類型Primertype序列(5'to3')Sequence(5'to3')1GH5-F1ForwardAGCACTGGCTGTTGTTACCGGH5-R1RevereCATCATCTGGGGCTCTCA2GH5-F2ForwardTAAGACGCTCCCTCAAGATGH5-R2RevereCTACTCCAACCACAACCCT3GH7EG-F1ForwardGGTATTCACGGCATTCGCGH7EG-R1RevereGCTCCACCAGACGCTCAT4GH7EG-F2ForwardCACAGGATGGTGGTAAGAGGH7EG-R2RevereGGATTCGGTGTTGTTTGAT5GH7EG-F3ForwardCAGGTATTCACGGCATTCGCGH7EG-R3RevereTCGCTCCACCAGACGCTCAT6GH7-EG-F4ForwardCGCCGACGCAGGTATTCACGGH7-EG-R4RevereTCCAGTCCCTCCAGTTCTGATGATG7GH7CBH-F1ForwardCACCGCTTCGGCTCTTATCGGH7CBH-R1RevereATCGCTGTCTGAGGGCTTCC8GH7CBH-F2ForwardGCACCTTGACCACCGAGACCGH7CBH-R2RevereCTGCCGATGGGACCGAACTTA9GH7CBH-F3ForwardACCGCCTCGGCTCTTATCGGH7CBH-R3RevereCGTCCGTAGAAGGTCTTGTTGC10GH7CBH-F4ForwardGCACCTTGACCACCGAGACCGH7CBH-R4RevereGCCGATGGGACCGAACTTAT11GH10-F1ForwardGCATACCCTTTCGGTTCTCCGH10-R1RevereGGGCTGGCAGTTTCTGTCGT12GH10-F2ForwardGCATACCCTTTCGGTTCTCCGH10-R2RevereTCAACGGCATCCCACTTCAT13GH10-F3ForwardGGAAAGCCAAGAGGAGCGGH10-R3RevereCCCGACCATCAACGACAG14GH10-F4ForwardCAGTTCAGTCCCACCACCGH10-R4RevereACGACAGCATCTCCTCCC15GH10-F5ForwardCTTCACCCTACGGTAACTCGGH10-R5RevereATGACAGCATCTCCTCCC

表2 Q7-31T菌株的RT-PCR反應(yīng)體系

1.5 基因片段克隆

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到Q7-31T菌株總cDNA，用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)cDNA產(chǎn)物的濃度和純度。后利用內(nèi)參GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)按照使用說(shuō)明的步驟，檢測(cè)cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶大小為496 bp。將cDNA產(chǎn)物-20℃下保存，作為進(jìn)一步擴(kuò)增模板。

參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[8]，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，試驗(yàn)確定最佳PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，后利用Touch Down PCR技術(shù)[9]進(jìn)行擴(kuò)增。Touch Down PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，65～50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共15個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，同時(shí)加入5 μL的DL2000 DNA Marker，120 V電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)是否有目的條帶，并記錄。將具有目的條帶的PCR產(chǎn)物用購(gòu)自上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果得到4種酶的氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析， Prot-Param在線軟件分析氨基酸序列及理化性質(zhì)，SOPMA在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，ProtScale Server在線軟件分析疏水性/親水性，NetPhos 2.0 server在線軟件分析潛在磷酸化位點(diǎn)，NetNGlyc 1.0在線軟件分析糖基化位點(diǎn)，InterProScan在線軟件預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)與域，Swiss-Model數(shù)據(jù)庫(kù)(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株植物細(xì)胞壁降解酶基因片段的克隆

2.1.1 Q7-31T菌株 Q7-31T菌株產(chǎn)植物細(xì)胞壁降解酶具有高效的天然木質(zhì)纖維素降解活性[10]。其發(fā)酵后胞外酶的質(zhì)譜鑒定，得到關(guān)于植物細(xì)胞壁降解的7種酶。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，Q7-31T菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物細(xì)胞壁降解酶分布在GH5、GH7和GH10 3個(gè)家族。其中GH5家族和GH10家族的酶全部為內(nèi)切酶，GH7家族中的GH7-314酶為內(nèi)切葡聚糖酶，CBH-C為外切葡聚糖酶。

2.1.2 PCR引物的篩選 經(jīng)篩選得到可擴(kuò)增出目的片段的引物，分別為2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、15號(hào)7對(duì)引物。

2.1.3 基因克隆與測(cè)序 通過(guò)RT-PCR得到4條植物細(xì)胞壁降解酶編碼基因部分片段，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，這4條部分片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)序列相一致(相似度大于或等于99%)，其對(duì)應(yīng)登錄號(hào)分別為gi|345566216、gi|1170138、gi|46241267、gi|1170139，其氨基酸序列與質(zhì)譜鑒定的結(jié)果相一致。

通過(guò)基因水平驗(yàn)證，以質(zhì)譜鑒定結(jié)果為依據(jù)，最終確定Q7-31T菌株的胞外全酶的植物細(xì)胞壁降解相關(guān)酶分為3個(gè)不同的家族：GH5家族，內(nèi)切葡聚糖酶；GH7家族，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(CBH-C)；GH10家族，內(nèi)切木聚糖酶。

2.2 菌株植物細(xì)胞壁降解酶的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因序列 GH5家族內(nèi)切葡聚糖酶GH5-281、GH7家族內(nèi)切葡聚糖酶GH7-314、外切葡聚糖酶CBH-C和GH10家族內(nèi)切木聚糖酶GH10-276 4種酶對(duì)應(yīng)的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為GH5-281，gi|345566250；GH7-314，gi|1170138；CBH-C，gi|46241268；GH10-276，gi|1170139，相應(yīng)的進(jìn)化關(guān)系如圖1，由于CBH蛋白屬于GH7家族，因此GH7-314與CBH-C的親緣關(guān)系較近、遺傳差異小，盡管GH5-281與GH10-276聚到一支，但這2種酶的遺傳差異較大。利用Prot-Param在線軟件，對(duì)4種酶的氨基酸序列進(jìn)行分析得到，氨基酸序列組成及理化性質(zhì)(表3)：4種酶的氨基酸數(shù)目為420～515個(gè)，其中CBH-C的氨基酸數(shù)目高達(dá)513個(gè)，而GH10-276僅含有385個(gè)氨基酸，分子量為44～55 KDa。酸性氨基酸占6%～10%，堿性氨基酸占6%～11%。理論等電點(diǎn)多小于7，GH7家族內(nèi)切葡聚糖酶理論等電點(diǎn)大于8。

圖1 4種酶的進(jìn)化關(guān)系

表3 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶序列

注：a為GH5-281，b為GH7-314，c為CBH-C，d為GH10-276。豎線從長(zhǎng)到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。

Note: a， GH5-281; b，GH7-314; c，CBH-C; d， GH10-276. Vertical line from long to short followed by: Alpha helix, Extended strand, Beta turn and Random coil .

圖2 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.2 Secondary structure of four kinds of cellulases from strain Q7-31T

表4 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu) 由圖2及表4可見(jiàn)，4種酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件均為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種，其中無(wú)規(guī)則卷曲的比例最高。4種酶中唯一的外切葡聚糖酶CBH-C的無(wú)規(guī)則卷曲比例高達(dá)61.99%，而β-轉(zhuǎn)角的比例卻低至3.12%，這與其外切葡聚糖酶的功能存在密切聯(lián)系。

2.2.3 疏水性/親水性 用ProtScale Server對(duì)率親環(huán)素蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，介于-0.5～+0.5的為兩性氨基酸(圖3)。這4種酶的親水性均大于疏水性，與4種酶均為水解酶，、作用環(huán)境為水環(huán)境有關(guān)。其中CBH-C酶的親水性明顯大于疏水性，與其作用方式為外切有關(guān)。

注：a為GH5-281，b為GH7-314，c為CBH-C，d為GH10-276。

Note: a，GH5-281; b，GH7-314; c，CBH-C; d， GH10-276.

圖3 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶的疏水性/親水性

Fig.3 Hydrophobicity/Hydrophilicity of four kinds of cellulases from strain Q7-31T

2.2.4 潛在磷酸化位點(diǎn) 分值大于0.5的氨基酸位點(diǎn)是酸化位點(diǎn)，這4種酶在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)3個(gè)氨基酸上均具有潛在的酸化位點(diǎn)(圖4)。對(duì)4種酶的潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表5)，總體上來(lái)說(shuō)其磷酸化位點(diǎn)總數(shù)較多，其中GH5-281和CBH-C的磷酸化位點(diǎn)數(shù)分別高達(dá)45個(gè)和38個(gè)，GH7-314、CBH-C和GH10-276絲氨酸上的潛在酸化位點(diǎn)數(shù)高于蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化位點(diǎn)數(shù)，而GH5-281在蘇氨酸上的磷酸化位點(diǎn)數(shù)則高于絲氨酸和酪氨酸上的磷酸化位點(diǎn)數(shù)。

2.2.5 糖基化位點(diǎn) 由圖5、表6可見(jiàn)，GH5-281、GH7-314、CBH-C這3種酶均存在1～2個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，不存在O-糖基化位點(diǎn)，而GH10-276纖維素降解輔助酶并不存在潛在的糖基化位點(diǎn)。

注：a，GH5-281；b，GH7-314；c，CBH-C；d，GH10-276。

Note: a，GH5-281; b， GH7-314; c，CBH-C; d，GH10-276.

圖4 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶潛在的磷酸化位點(diǎn)

Fig.4 Potential phosphorylation sites of four kinds of cellulases from strain Q7-31T

表5 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶潛在的磷酸化位點(diǎn)

注：位點(diǎn)比例為潛在磷酸化位點(diǎn)占蛋白質(zhì)總氨基酸數(shù)的比例。

Note: The number accounting for potential phosphorylation sites in the protein of the total number of amino acids ratio.

注：a，GH5-281；b，GH7-314；c，CBH-C；d，GH10-276。

Note: a,GH5-281; b,GH7-314; c,CBH-C; d, GH10-276.

圖5 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶潛在的糖基化位點(diǎn)

Fig.5 Potential glycosylation sites of four kinds of cellulases from strain Q7-31T

表6 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶糖基化位點(diǎn)

注：++，預(yù)測(cè)結(jié)果可能性極高；+，預(yù)測(cè)結(jié)果可能性高；±，預(yù)測(cè)結(jié)果存在一定的可能性；-，預(yù)測(cè)沒(méi)有糖基化位點(diǎn)。位點(diǎn)總數(shù)：閾值>0.5的位點(diǎn)總數(shù)。

Note: + +,high probability prediction; +, high probability prediction; ±,There is a certain possibility that prediction; -,no predicted glycosylation sites. Total points: threshold > 0.5.

2.2.6 功能結(jié)構(gòu)域 由圖6可見(jiàn)，GH5-281的第18位至第54位為纖維素結(jié)合域，第115位至第416位為催化域和家族識(shí)別序列；GH7-314的第20位至第417位為催化域和家族識(shí)別序列，沒(méi)有纖維素結(jié)合域；CBH-C的第477位至第513位為纖維素結(jié)合域，第18位至第453位為催化域和家族識(shí)別序列；GH10-276的第17位至第53位為纖維素結(jié)合域，第88位至第385位為催化域和家族識(shí)別序列。家族識(shí)別序列表示，GH5-281屬于GH5蛋白質(zhì)家族，GH7-314、CBH-C屬于GH7蛋白質(zhì)家族，GH10-276屬于GH10蛋白質(zhì)家族，這一結(jié)果也同質(zhì)譜鑒定的結(jié)果相同。

圖6 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶的功能結(jié)構(gòu)域

注：a，GH5-281(gi|23200107)；b，GH7-314(gi|2624625)；c，CBH-C(gi|683437155)；d，GH10-276(gi|3915312)。括號(hào)內(nèi)為使用的模板。

Note: a，GH5-281 (gi|23200107); b， GH7-314 (gi|2624625); c，CBH-C (gi|683437155); d，GH10-276 (gi|3915312). The templates are in brackets.

圖7 Q7-31T菌株4種植物細(xì)胞壁降解酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.7 Tertiary structures of four kinds of cellulases from strain Q7-31T

2.2.7 三級(jí)結(jié)構(gòu) 由圖7可見(jiàn)，4種酶的空間構(gòu)型均為C字形，即存在中空結(jié)構(gòu)，酶的比表面積大。

3 結(jié)論與討論

3.1 少量的糖基化位點(diǎn)

對(duì)4種酶的糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GH10家族內(nèi)切酶不含糖基化位點(diǎn)，其余3種酶均含1～2個(gè)糖基化位點(diǎn)。蛋白酶的酶切位點(diǎn)大多在連接區(qū)(linker)附近，而外切酶連接區(qū)糖基化，內(nèi)切酶連接區(qū)未糖基化，外切酶的連接區(qū)中含有一些可能的蛋白酶切位點(diǎn)，而內(nèi)切酶的連接區(qū)中無(wú)，其與防止蛋白酶切有著密切的聯(lián)系[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CBH-C酶的連接區(qū)中存在糖基化位點(diǎn)，這與上述理論相符。然而另外2種內(nèi)切酶中含有糖基化位點(diǎn)，且部分糖基化位點(diǎn)位于催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain，CD)上，這與高培基[4]的發(fā)現(xiàn)不符，糖基化位點(diǎn)可能存在其他方面的作用，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 高比例的催化結(jié)構(gòu)域

3種纖維素降解酶均含CD，GH5家族內(nèi)切酶和GH7家族外切酶均含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain，CBD)和連接區(qū)，而GH7家族內(nèi)切酶不含CBD。CBD是一面親水，另一面疏水的楔形結(jié)構(gòu)，能插入和分開(kāi)纖維素的結(jié)晶區(qū)，在其吸附于纖維素分子鏈表面后，酶分子連接到纖維素上，可能提高底物表面有效酶的濃度，或可能促進(jìn)纖維素表面單個(gè)葡聚糖鏈的溶解，具有疏解纖維素鏈的作用[3]，降低和打破纖維素內(nèi)非共價(jià)連接的氫鍵網(wǎng)絡(luò)[11]。汪天虹[12]、高培基等[4]的報(bào)道證實(shí)這一理論。雖單一的CD或CBD仍然可表現(xiàn)出水解和吸附能力，但任何單一或者兩個(gè)結(jié)構(gòu)域等物質(zhì)的量的混合液水解或吸附能力均遠(yuǎn)低于其相應(yīng)的全酶分子[4]。當(dāng)CBD和CD同時(shí)存在，且存在連接區(qū)時(shí)，在植物細(xì)胞壁降解酶分子折疊過(guò)程中，其三維構(gòu)象發(fā)生改變，影響整個(gè)酶的活性[4]。

本研究中Q7-31T菌株中CBH-C酶的CBD位于C端，CD位于N端，這可能與酶分子的空間結(jié)構(gòu)和協(xié)同作用存在著密切的聯(lián)系。肖志壯[13]對(duì)EGI酶C端的CBD切除以后，在N端加入CBD，進(jìn)行重組表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，纖維素降解活性顯著下降，這一研究也對(duì)CBD的位置與酶分子的空間結(jié)構(gòu)和協(xié)同作用存在密切聯(lián)系這一理論提供一定支持。GH7家族內(nèi)切酶不含CBD，而含有高比例的CD，這可能與其具有更高效、專一的催化作用有關(guān)。

3.3 多變的三維構(gòu)象

根據(jù)植物細(xì)胞壁降解酶分子的空間結(jié)構(gòu)，高培基等[4]提出了內(nèi)、外切植物細(xì)胞壁降解酶與底物作用時(shí)底物專一性不同的運(yùn)動(dòng)模式：CBH活性部位呈桶狀，只能允許單根纖維分子鏈進(jìn)入，EG活性部位為一開(kāi)放的裂隙，可使酶分子鑲在纖維表面上，進(jìn)行隨機(jī)性內(nèi)切，水解出纖維寡糖。本研究證實(shí)了這一運(yùn)動(dòng)模式的合理性。本研究對(duì)4種酶進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬后發(fā)現(xiàn)，4種酶均呈C字形，中間有一凹槽，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，4種酶的CD中均含有豐富的色氨酸，色氨酸很有可能與酶和纖維素的結(jié)合有關(guān)[14]。同時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，4種酶中存在大量的無(wú)規(guī)卷曲，酶分子呈現(xiàn)多變的三維構(gòu)象，更有利于酶與底物結(jié)合和作用。

3.4 大量的磷酸化位點(diǎn)

比較4種酶潛在的磷酸化位點(diǎn)數(shù)，總體上來(lái)說(shuō)其磷酸化位點(diǎn)總數(shù)均很多，而且絲氨酸上的潛在磷酸化位點(diǎn)數(shù)普遍高于蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化位點(diǎn)數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性越大[15]。大量磷酸化位點(diǎn)的存在，為4種酶發(fā)揮更多作用，表現(xiàn)更高效的活性提供基礎(chǔ)。

3.5 高效的協(xié)同作用方式

木質(zhì)纖維素通常含有木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，是一個(gè)致密的結(jié)構(gòu)。本研究的質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，Q7-31T菌株胞外酶中含有大量GH10家族的內(nèi)切木聚糖酶，用于水解木質(zhì)素。結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果表明，GH5家族的內(nèi)切酶含有CBD，而GH7家族的內(nèi)切酶不含CBD。分析其作用方式：GH5家族內(nèi)切酶的CBD將纖維素鏈?zhǔn)杞夂?，GH5家族和GH7家族內(nèi)切酶的CD進(jìn)一步降解纖維素鏈。在水解木質(zhì)纖維素時(shí)，纖維素酶和木聚糖酶能互相改善彼此性能，因?yàn)槟举|(zhì)纖維素中的木聚糖和纖維素相互覆蓋[16]。

結(jié)合已有的相關(guān)纖維素降解理論和本研究對(duì)Q7-31T菌株植物細(xì)胞壁降解酶系的分析，對(duì)Q7-31T菌株植物細(xì)胞壁降解酶降解植物細(xì)胞壁的作用方式進(jìn)行預(yù)測(cè)：首先，GH10家族的木聚糖酶結(jié)合木質(zhì)纖維素降解表面的木質(zhì)素，打開(kāi)缺口；隨后GH5家族內(nèi)切酶的CBD將纖維素鏈?zhǔn)杞夂螅珿H5家族和GH7家族內(nèi)切酶的CD以隨機(jī)作用的方式將纖維素分子切割成短纖維素鏈、纖維寡糖或葡萄糖；然后，GH7家族外切葡聚糖酶從纖維素鏈、纖維寡糖末端進(jìn)行切割，形成纖維二糖；最后，由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖切割成為葡萄糖。整個(gè)過(guò)程同時(shí)且反復(fù)地進(jìn)行。

對(duì)鐮刀菌屬Q(mào)7-31T菌株胞外全酶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行基因水平的驗(yàn)證，將其植物細(xì)胞壁降解相關(guān)酶歸為GH5、GH7和GH10 3大家族，并根據(jù)作用特點(diǎn)分為內(nèi)切葡聚糖酶：GH5家族、GH7家族；外切葡聚糖酶：GH7家族；內(nèi)切木聚糖酶：GH10家族。少量的糖基化位點(diǎn)、高比例的催化結(jié)構(gòu)域、多變的三維構(gòu)象、大量的磷酸化位點(diǎn)與高效的協(xié)同作用方式可能決定Q7-31T菌株的植物細(xì)胞壁降解酶對(duì)植物細(xì)胞壁的高效降解。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Structure of Plant Cell Wall Degrading Enzymes fromFusariumStrain Q7-31T

ZHAO Lianzheng1， XIE Zhanling1,2*， JIA Xianqing1

(1.CollegeofEco-EnvironmentalEngineering,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai810016; 2.NationalKeyLaboratoryBreedingBaseforInnovationandUtilizationofPlateauCropGermplasm,Xining,Qinghai810016,China)

For exploring the mechanism of high-efficiency plant cell wall degradation process based on plant cell wall degrading enzymes fromFusariumstrain Q7-31T, for the gene cloning and biological analysis, the methods respectively were PCR amplification and some bioinformatic softwares such as Prot-Param, SOPMA and ProtScale Server. Results: The plant cell wall degrading enzymes in Q7-31T are classified as: GH5 family endoglucanase, GH7 family endoglucanase, GH7 family exo-glucanase and GH10 family endoxylanase, which are consistent with mass spectrometry. The enzymes are medium molecular size, and the secondary structure consists of four elements:α-helix, extended strand,β-turn and random coil, of which random coil is most abundant; four enzyme classes are hydrophilic enzymes, and have higher proportion of phosphorylation sites. There are 1～2 glycosylation sites. Four enzymes are present in a higher proportion of catalytic domains and the tertiary structure of a hollow “C”shape. Conclusion: A small number of glycosylation sites, high proportion of catalytic domains, changeable three-dimensional conformations, large number of phosphorylation sites and high-efficiency synergism probably determine the high-efficiency degradation of plant cell wall degrading enzymes in strain Q7-31T.

Fusarium; plant cell wall degrading enzymes; structure

2014-11-01； 2015-04-10修回

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“Q7-31植物細(xì)胞壁降解酶系組成及協(xié)同作用研究”(31260021)

趙聯(lián)正(1993-)，男，在讀本科，專業(yè)方向：生物技術(shù)。E-mail:zhaolianzheng114@163.com

*通訊作者：謝占玲(1966-)，女，教授，博士，從事真菌及酶學(xué)研究。E-mail:xiezhanling2012@126.com

1001-3601(2015)05-0256-0138-08

Q932

A